有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响开题报告

全文总字数：10951字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.选题背景及研究现状

1.1抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，args）污染研究现状

1.1.1耐药菌的产生

2. 研究的基本内容和问题

3.研究的目标、内容和拟解决的关键问题

3.1研究内容

依据实验方案，选择三种有机氯农药（ddt、hch、氯丹）在不同浓度范围对供体菌（hb101）和受体菌（jm108）进行接合实验，筛选接合子，计算接合率，提取接合子dna进行验证。

3. 研究的方法与方案

4.研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

4.1.研究材料及技术路线

4.1.1实验材料

（1）供体菌HB101

卡那霉素抗性（Km^R）、氨苄霉素抗性（Am^R）、四环素抗性（Tc^R）其物理与遗传图谱见图1.1。

（2）受体菌JM108

萘啶酮酸抗性(Na^R)；由于IS186转座子的插入，缺乏离子蛋白酶表达；基因型为：endA1 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 glnV44 Δ(lac-proAB)hsdR17(rK-mK )。

（3）三种有机氯农药

（4）抗生素储备液

抗生素溶液配制完成后，需要用0.22μm水相滤头过滤除菌，分装保存于-20℃保存，保存时间不超过一周。使用前，于室温下融化，吸取适量于培养基中。

（4）培养基

a.LB培养基：

胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl 10g；水800ml.

加热使之完全溶解，然后加水定容至1L。

分装于三角瓶中，高压121℃下灭菌15min，冷却备用。

b.LB琼脂培养基：

胰蛋白胨10g；酵母粉5g；NaCl10g；水800ml；12g琼脂粉

加热使之完全溶解，然后加水定容至1L。

分装于三角瓶中，高压121℃下灭菌15min，冷却备用。

使用时，加热使之溶解，冷却至50℃左右再加入抗生素混匀。

c.细菌滤膜

将0.22μm的滤纸，剪成直径1~2cm大小，放在玻璃平板中，用报纸包好灭菌，烘干。

（6）其他试剂

a.生理盐水：0.85%的NaCl水溶液，121℃灭菌15min，冷却备用

b.甲醇

c.PBS缓冲液：

NaCl 137mmol/L ; Na₂HPO4 10 mmol/L ; KCl 2.7mmol/L

KH₂PO₄2mmol/L ; pH 7.4

121℃灭菌15min后冷却备用

（7）细菌质粒提取试剂盒

（8）PCR试剂：Taq Mix

（9）琼脂糖电泳试剂：

琼脂糖，Tris-硼酸（TBE）缓冲液

4.1.2技术路线

4.2.实验方案

4.2.1受体菌和供体菌对抗生素耐受浓度测定实验

a.实验目的：两种抗性菌分别对两种抗生素的最高耐受浓度

b.实验步骤：

分别将供体菌、受体菌接种在2支装有5mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养12h。

分别吸取0.1ml菌液，涂布到含不同浓度抗生素的平皿上，供体菌实验组的卡那霉素素浓度分别设置为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85mg/mL，受体菌实验组的萘啶酮酸浓度分别设置为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、10⁵mg/ml。37℃恒温培养，分别菌落计数。

细菌计数采用平板倾注培养计数法，通过计算存活率，拟合到四参数的logistic方程中，从而计算得到半抑制浓度）以下为实验、数据处理方法：

操作：向已灭菌的平板中倒入约10ml已灭菌融化的含有不同浓度的抗生素LB琼脂培养基，抗生素于50℃左右再加入LB培养基，待冷却至约45~50℃时，取0.1ml菌液接种于灭菌平板，每个样本3个平行，轻轻转动平板，使菌液与抗生素混合均匀，冷凝后将平板倒置于37℃恒温培养24h，按照细菌活菌平板计数方法进行计数。

数据处理：

存活率

存活率（%）=N_i^j/N₀×100%

式中，

N_i^j：加入抗生素j的第i实验组的单位体积菌液的菌落（CFU·mL^-1），抗生素j包括卡那霉素和萘啶酮酸；

N₀：对照组（即无抗生素平板）的单位体积菌液的菌落（CFU·mL^-1）

剂量效应与半抑制浓度

四参数Logistic方程用于拟合抗生素对菌液中总菌群的剂量效应曲线。四参数Logistic方程如下：

存活率（%）=（A₁-A₂）/[1 （x/x₀）^p] A₂

式中：

A₁：无抗生素添加的效应值，设定初始值为100；

A₂：抗生素添加足够多时的效应值，设定初始值为0；

x₀：半抑制浓度（mg·L^-1），即IC₅₀；

x：添加的抗生素浓度（mg·L^-1）；

p：曲线坡度参数

将存活率和相对应的抗生素浓度输入软件Origin8.0，选择药物剂量效应S曲线拟合，获得菌液中总菌数对于相应抗生素的半抑制浓度。

4.2.2细菌的培养和接合转移实验

(1)菌液培养

将两个抗性菌株接种于2支装有10mlLB培养基的试管中，在37℃下振荡培养12h（加相应抗生素）、用PBS缓冲液离心清洗三次；测定OD600，调整菌液至特定浓度。

(2)混合接触

吸取等体积的供体菌、受体菌悬液于2ml EP管中，加入等体积不同浓度的有机氯农药（用甲醇稀释），轻轻搓转，动作要慢，使供体菌和受体菌充分接触，同时避免刚接触的配对又被分开，混匀后，涂布至含有滤膜的培养基上37℃恒温静置培养。用无机盐冲洗滤膜定容梯度稀释得到的接合反应后的菌悬液。

同时设四个对照组：

1.受体菌、供体菌分别在最高浓度的有机氯农药的培养基中培养；

2.受体菌在无农药污染，单抗的培养基中培养；

3.因为农药由甲醇溶解，设置不加农药的情况下，加入最大体积的甲醇在培养基中培养。

(3)涂布筛选

将混合菌液涂布于含两种特定抗生素的双抗琼脂平板，待凝固后，37℃培养18-24小时，计数菌落数。

设置的四个对照组与目的实验的操作相同，以保证实验条件相同。

4.2.3接合转移频率的计算

接合转移频率是表征接合转移质粒（耐药基因)发生的程度，一般表示为单个受体菌细胞能发生接合转移的细胞个数。接合转移频率按照公式（1.1）计算：

F=N_O·T/N_O·R公式（1.1）

f：接合转移频率

No._T：接合子数量（CFU/ml）

No._R：受体菌数量（CFU/ml）

4.3可行性分析

4.3.1与本项目有关的研究工作积累和已有的研究工作成果

该实验相关人员进行了文献调查和学习，对有机氯农药、细菌耐药性、基因的接合转移有了基本的了解和认识，并且具有相关的实验经验。

本项目的指导老师为刘娟老师，指导老师可以科学合理的解决实验过程中遇到的问题并进行指导，从而能确保本课题的顺利完成。

4. 研究创新点

5.特色或创新之处

本研究首次基于细菌耐药性和基因的接合转移，探究有机氯农药对大肠杆菌接合效率的影响。

5. 研究计划与进展

6.研究计划及预期进展