水稻金属耐受蛋白OsMTP7基因敲除材料构建及蛋白亚细胞定位研究开题报告

全文总字数：11841字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究背景、研究意义：

国内外研究进展：

1.金属耐受蛋白编码基因探究：

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

探究osmtp7基因在水稻中主要的表达部位以及该基因在细胞中的表达位置，揭示该基因在水稻锌锰调控过程中的功能和作用机理。

研究内容

1.构建水稻中金属耐受蛋白（osmtp7）的crispr基因敲除材料，获得基因缺失株型

3. 研究的方法与方案

研究方法

水培野生型水稻，结合分子生物学的手段，采用RT-PCR技术，对水培植株不同部位OsMTP7基因的表达量进行分析比较。构建GFP融合载体，侵染烟草，利用亚细胞定位分析OsMTP7基因在细胞中的表达位置。

技术路线

实验方案

1.CRISPR/Cas9载体构建

1.1靶点引物设计

根据引物设计原则和水稻各品质性状候选基因序列，靶点的GC不宜低于40，以提高打靶效率。对靶点序列进行特异性分析，用靶点序列＋ＮＧＧ与水稻基因组特异性分析，尽量避免靶点序列与水稻基因组其它位点比对差异多于５个碱基。

1.2 菌种活化和质粒提取制备及其质量检测

将选好的pYLCRISPR/Cas9质粒菌种和pYLgRNA-U3/U6质粒菌种分别在含有卡那霉素(25g/mL)和氨苄青霉素(100 g/mL) LB平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落用LB液体培养，并用质粒提取试剂盒提取质粒。用2-3U BsaⅠ试切约150ng质粒，电泳检查。

1.3 sgRNA表达盒的构建

我们将利用overlapping PCR法构建sgRNA表达盒。

（1）第一轮PCR

此步骤的目的是分别将靶点序列引入到U3/U6启动子下游和sgRNA序列的上游。

扩增25~26个PCR循环 95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s。

取3-5 L PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳检查。

表1 表达盒构建的第一轮PCR反应体系

试剂	加入量
2× Phanta Max Buffer	7.5 L
10 mmol/L dNTPs Mix	0.25L
Phanta Max Polymerase	0.2U
YLg RNA-U6/U3	2-5ng
10 mol/L U-F和U#-T#	各0.3 L (反应1)
10 mol/L gR-T#和gR-R	各0.3 L (反应2)
ddH2O	补足到15L

（2）第二轮PCR

此步骤目的是将启动子、靶点和sgRNA构建成完整的表达盒。

取第一轮PCR产物1l用H₂O稀释10倍，各取1l混合为模板。各表达盒20-50lPCR。加入1/10量每种引物组合工作液。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。

扩增17-20循环：95℃ 10s，58℃ 15s，68℃ 20s。

取2-3 L PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳检查。

1.4 酶切-连接反应

表2 酶切-连接反应体系

试剂	加入量
10×CutSmart Buffer	1.5l
10mM ATP	1.5l
pYLCRISPR/Cas9质粒	60-80ng
sgRNA表达盒混合物	每表达盒10-15ng
BsaⅠ-HF	10U
T4 DNA ligase	35U
ddH2O	补充到15l

扩增10-15个循环：37℃ 5min，10℃ 5min，20℃ 5min，37℃ 5min。

1.5 连接产物转化

将定量的连接产物滴载在悬浮式透析膜，它的孔径是0.025pm，在４℃冷柜内用0.2×TE稀释脱盐透析20min；取1l连接产物与20l大肠杆菌感受态细胞混合，吸取至预冷的电激杯，以1.8kv/20l感受态细胞电激转化，将菌体转入1ml SOC培养基中37℃摇晃培养1h。在LB培养基板涂板含有25吨/mlKan，0.5mM IPTG和适量X-gal。培养过夜，LacZs表达产生蓝色菌斑为阳性克隆。

1.6 阳性克隆检测

挑取数个蓝色(如果使用了LacZ)菌落培养和提取质粒，并用MluⅠ或Ⅰ酶切和电泳确认。也可以用菌落PCR进行筛选，用灭菌牙签挑取菌落的少量菌作为模板，对一个或所有靶点进行PCR检测。引物配对形式为：SP-R引物与第一表达盒启动子反向引物配对；第一靶点接头正链引物与第二靶点负链引物配对；第二靶点正链引物与第三靶点负链引物配对；第三靶点正链引物与第四靶点负链引物配对；如此类推。选1个阳性克隆进行测序。

1.7 pYLCRISPR/Cas9载体导入农杆菌

将获得的阳性克隆提取质粒，并电激转化农杆菌（如EHA105）。 如果要做质粒在农杆菌的稳定性检测，从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5 ng质粒为模板，用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR，然后电泳检测确认。如果表达盒结构未发生变化，获得的农杆菌可用于植物转化。

2.OsMTP7蛋白的亚细胞定位分析

2.1水稻cDNA的制备

提取出水稻总RNA，将总RNA反转录为cDNA。反应体系如表3所示，30℃ 10 min，

42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

表3 反转录反应体系

试剂	加入量
RNase Free H2O	1l
Rom Primer（25 mol/L）	1l
RNase Inhibit（10 U/L）	1l
dNTP Mixture（各 10 mmol/L）	2l
5×RT buffer	4l
RNA	10l
Rever TraAce	1l
总体积	20l

2.2亚细胞定位瞬时表达载体的构建

根据水稻OsMTP7基因在NCBI数据库中序列设计引物，以水稻的cDNA为模板，扩增带有酶切位点的OsMTP7的ORF全长（去除终止子）。采用10l体系进行PCR反应：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，重复34个循环；72℃ 10 min。扩增完成后进行1.0琼脂糖凝胶电泳检测。目的基因片段进行切胶回收并纯化。将纯化的目的基因片段连接到pMD18-T克隆载体上，转化农杆菌感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，提取质粒后进行测序分析。

表4 PCR反应体系

试剂	加入量
H2O	6.3l
10×buffer	1.0l
LecRK-F（10 mol/L）	0.3l
LecRK-R（10 mol/L）	0.3l
dNTP（2.5 mmol/L）	1.0l
cDNA	1.0l
Taq 酶（5 U/L）	0.1l
总体积	10.0l

2.3烟草叶片瞬时表达

采用注射器直接将农杆菌注射至叶片下表皮细胞间隙方法的技术流程是 烟草植株21℃土培5-6周，光周期为14 h /d。挑取农杆菌单菌落于4 mL YEB培养基中，28℃200 r/min 过夜培养。吸取1-1.5 mL菌液置于50 mL YEB培养基中，28℃继续培养8 h。室温下2200 g 离心10 min。弃上清，用 50 mL 渗透液( 250 mg D－葡萄糖、5 mL 50 mmol /L MES、5 mL 2 mmol /L Na3PO4·2H2O、5L 1 mol /L乙酰丁香酮) 重悬至D600 nm为 1.0，室温放置至少 3 h。用无菌1 mL 医用注射器吸取菌液，将针头刺入下表皮，轻轻将菌液注射进下表皮空隙中。烟草注射菌液后继续在 22-24℃ 下培养，36 h后进行荧光检测。

3.水培试验

用中花11野生型水稻种子进行水培实验，在营养元素充足和生长环境一致的情况下，在温室内培养4周。从第5周开始，对其设置不同的锌锰浓度处理：0.05, 0.5, 5, 10, 100, 和1000 M。 并在0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h对植株的地下部和地上部分别采用RT-PCR测定目的基因的mRNA含量，以分析目的基因在不同锌锰离子浓度处理下，在植株不同部位的表达程度。

可行性分析

1.实验技术方法成熟：

项目组指导教师在植物营养与抗逆的分子遗传学和重金属污染研究方面积累了丰富经验，实验技术方法成熟，已发表多篇相关文章。本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中，可以在预期时间内完成课题，并完成结题报告。

2.研究基础

国内外学者对金属耐受蛋白及其编码基因调控机理等方面都曾进行过一系列研究，有大量可供参考资料。

3.试验条件与设备齐全：

项目组依托南京农业大学作物遗传和种质创新国家重点实验室，具备本项目实施所需的各种实验技术方法及实验设备，实验条件成熟。

4.申请者及所在科研团队学习及科学研究能力强：

所在课题组科研氛围浓厚，课题组成员都拥有良好的实验技能，能够熟练地掌握分子生物学实验操作，有利于探讨交流，取长补短；并且申请者都具有不怕苦不怕累的精神，勇于进取，勤于探索，积极参与实验。

4. 研究创新点

1.目前已有研究表明osmtp8.1被定位在在水稻液泡上，用于调控对锰的吸收和转运，但其同族基因osmtp7对于锌、锰的调控机理未见报道，所以osmtp7对锌、锰的吸收以及在水稻体内的代谢调控过程的分子机理有待进一步深入研究。本项目通过对osmtp7在不同部位表达量的分析以及亚细胞定位，探讨osmtp7对锌、锰的平衡调节机制。

2.实验通过分子生物学的技术手段，运用crispr基因编辑、定时定量pcr以及亚细胞定位等方法，在分子水平上对水稻中锌、锰的吸收转运机理进行分析探究。

5. 研究计划与进展

2019年2月-2019年3月：了解课题要求，查找资料及实验设计

2019年3月-2019年4月：crispr载体构建；亚细胞定位瞬时表达载体的构建；水培试验测定材料准备

2019年4月-2019年5月： osmtp7蛋白亚细胞定位分析；定期测定水培试验的蛋白表达程度