金属离子对藻胆蛋白生物合成影响的研究开题报告

早在上世纪初，就有报道中提到蓝藻和红藻中存在强烈荧光性的红色、紫罗兰色和蓝色蛋白质，后有学者将这些蛋白质定名为藻蓝蛋白，并不断有人在其他藻类中发现了藻胆蛋白的存在。

在国外，Lijima通过小白鼠实验提出了藻蓝蛋白能够增强免疫力，抵抗各种疾病的说法，后有日本Tohoku大学牙科院、哈佛医学院证实了藻蓝蛋白的这一作用。1988年，Morcos通过实验证明了是一种无毒无副作用的光敏剂。目前，大日本油墨公司已将以Lina-blue-A命名的藻蓝蛋白用于化妆品的生产。

藻蓝蛋白由于其生物活性而具有广泛的应用前景，因而藻蓝蛋白的分离纯化也一直是我国研究的热点。主要分为提取原料、细胞破碎和分离纯化三步。藻蓝蛋白广泛存在于红藻、蓝藻等海藻中，不同藻类中藻蓝蛋白的含量和种类都不一样，即使是同一种藻类在不同状态下所含藻蓝蛋白的含量也不一样，藻类成熟之前的藻蓝蛋白含量是最高的，新鲜的藻泥中的含量也要比晒干的藻粉中的含量高。藻蓝蛋白是一种胞内蛋白，要从海藻中获得可供食品和医疗使用的高纯度的藻蓝蛋白，必须对海藻进行细胞破碎、粗提、纯化处理，即首先把海藻细胞的细胞膜、细胞壁破碎，使得藻蓝蛋白能够释放出来，但是随藻蓝蛋白一起释放出来的还有细胞内的其他物质，所以要对藻蓝蛋白进行第二步的粗提处理，得到较高浓度的藻蓝蛋白；不同用途的藻蓝蛋白具有不同的纯度要求，用在食品生产上的藻蓝蛋白的纯度要大于0.7，在药品生产中的藻蓝蛋白的纯度要大于3.0，参与试剂合成的藻蓝蛋白的纯度要求则更高，需达到4.0，粗提后，藻蓝蛋白的纯度虽有提高但还没达到商品应用标准纯度，需要进行最后一步的纯化处理，进而得到高纯度的藻蓝蛋白。要想提高藻蓝蛋白的产量，可以选择藻蓝蛋白含量高的藻类作为提取原料，也有学者研制出的新的藻类中藻蓝蛋白的含量要高于一般藻类。另外以上三个步骤都可以通过多种方法实现，有些方法效率高但所需周期长；有些方法简单易行，但不易获得高纯度的藻蓝蛋白；还有一些方法需要配合其他一些方法

混合使用等，这些都不利于藻蓝蛋白的大规模的生产和使用，可以通过改进分离提纯方法来提高藻蓝蛋白的产出。其次还可以通过生物合成的方法来生产藻蓝蛋白。

藻蓝蛋白的合成是一个复杂的过程，研究得比较详细的是蓝藻中的Synechococcus sp.PCC 7002。在该藻种中的七个多肽链上有8个不同的色素连接位点，且所有发色基团均为藻蓝胆素。其中cpcE基因和cpcF基因编码的蛋白，当它们共同作用时，对于催化藻蓝蛋白的-亚基与发色团连接过程非常重要。Fairchild等的工作也证明，cpcE和cpcF在大肠杆菌中表达的蛋白能够在体外特异性地催化藻蓝胆素连接到藻蓝蛋白-亚基的色素连接位点，即Cys-84上，并形成正确的反应物。CpcE和CpcF是被发现的第一个具有特异性位点催化的藻蓝色素蛋白裂合酶。通过对CpcE和CpcF的功能研究和蛋白同源性比对，可能发现其他一系列的色素蛋白裂合酶，同时也可能清晰地研究藻蓝蛋白的生物合成途径。但是同时，Glazer等也指出：仅仅运用同源性搜索方法来发现的裂合酶数目无法满足藻胆色素结合位点的数目。到目前为止，藻红蛋白上的几个色素结合位点的酶还没有完全确定。大部分藻蓝蛋白脱辅基蛋白与发色团的连接都是需要裂合酶催化的。上述表明藻蓝蛋白PC的-亚基与发色团的连接是由cpcE和cpcF基因所编码的裂合酶催化的，而pec操纵子与cpc操纵子类似，PEC的亚基与PC的亚基、cpcE与pecE对应的蛋白产物、cpcF与pecF对应的蛋白产物，分别有高度的同源性，zhao等也证明pecE、pecF编码的蛋白在-PEC脱辅基蛋白与色素的连接过程中起到催化作用。

John等人在Fremyella diplosiphon中构建了CpeT的突变体，实验发现在CpeT缺失的突变体中，藻红蛋白PE不能被检测到，根据色素蛋白合成途径，推测它们是催化脱辅基蛋白CpcB/A与藻胆色素结合的裂合酶。为了进一步研究CpeT的结构与功能，Shen等人在John等工作的基础上，通过同源性分析，在Synechococcus sp. PCC7002中发现了一个与CpeT同源性较高的基因CpcT，研究发现CpcT是一种新的裂合酶，催化PCB与CpcB中155位半胱氨酸的连接。此外，Zhao等在鱼腥藻（Anabaena sp. PCC7120）中，经过研究发现，编码号为alr0617的蛋白CpeS1可以催化藻蓝胆素PCB与CpcB和PecB中84位半胱氨酸的连接。与此同时，Zhao等也证实在鱼腥藻PCC7120中，还有一类与CpcT同源的蛋白CpeT1，是催化CpcB和PecB中155位半胱氨酸与PCB连接的裂合酶。藻蓝蛋白生物合成过程的阐明为生产这种荧光色素蛋白创造了条件。同时，在合成的过程中，藻蓝蛋白的产量也受到外在条件的影响，包括表达温度、诱导剂浓度、pH值、培养基类型、氧气浓度、金属离子等。研究人员发现，藻胆蛋白最好的表达条件是温度为20度、诱导剂浓度偏高、pH值中性的情况下，具有较高的产率。但是，重金属离子对合成的影响一直没有报道。