不同氧生境下活性污泥中四环素抗性基因的消减开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

四环素类抗生素 (tetracyclines, tcs)具有抗菌抑菌的重要作用，现已广泛应用于医疗卫生、畜禽养殖等领域。然而，由于缺乏对抗生素正确使用的认识，造成了医院和养殖场对抗生素的过量使用。2013年中国抗生素原料药产量达 16.2万吨^【1】，位居世界第一。这使得人畜粪便中残留的大量抗生素进入环境，增加了对环境中微生物的选择压力，加强了抗性基因（args）的传播。

现已发现的四环素类抗性基因种类就达到40种以上，如tet a、tet b、tet c等。相关研究已经证实，长期向土壤中施加四环素残留的猪牛羊粪将会促使出现抗性基因，并产生一系列的耐药菌，使得施加过这些肥料的田地成为抗性基因的一个重要储藏库^【2】，对自然环境和人类健康造成了极大的威胁。城市污水处理厂作为城市生活污水排往环境的“源”和“汇”^【3】，担负着减少环境中抗性基因污染的重要作用，何基兵等^【4】的研究表明，城市污水处理设施中污泥的抗性基因检出率最高，污泥对抗性基因的吸附作用是其在污水处理设施中的重要分配过程。因此，深入研究四环素抗性基因在活性污泥中的分布情况、去除手段具有十分重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

四环素抗性基因污染问题近几年受到了广泛关注，相关研究正陆续开展。此次实验的目标在于通过向污泥中添加重金属离子（Cu² 和Zn² ），研究其对活性污泥中四环素抗性基因的削减效果。实验将设置厌氧和好氧两种氧生境，每种情况下设4个对照组，将添加过重金属离子的活性污泥在不同氧生境下进行培养，每一段时间测定活性污泥中四环素抗性基因的基因丰度，得到不同重金属离子对活性污泥中四环素抗性基因的削减效果曲线。

3. 研究的方法与方案

本实验选择厌氧和好氧两种不同氧生境，设置对照组来研究cu² 和zn² 对四环素类抗性基因的削减效果，具体方案为：取污水处理厂二沉池的回流污泥，在适宜条件下于摇床中进行活化培养7天。同时配置人工废水，废水的成分为1 ml微量元素、0.03 g葡萄糖、0.4 g无水乙酸钠、0.015 g nh4cl、0.045 g kh2po4、0.02 g mgso4·7h2o。取150ml活化好的活性污泥和150ml人工废水，混合得到300ml泥水混合物后开始实验。在厌氧和好氧两种不同的氧生境下，设置5组处理，每组处理3个重复，分别为：空白对照（ck）、四环素、四环素 cu² 、四环素 zn2 、四环素 cu2 zn2 。其中，四环素以0.1g/l盐酸四环素溶液的形式添加，每瓶加入量为0.3 ml；cu2 以5g/l的cuso4·5h2o溶液形式添加，每瓶加入量为0.3 ml。zn2 以5 g/l 的zncl2溶液形式添加，每瓶加入量为0.3 ml。本实验共设置30个样本，全部放入摇床（25℃、160rpm）中培养，好氧生境采用锥形瓶，厌氧生境采用蓝盖瓶。

前期每七天取样一次，后期每十二天取样一次。每次取样时需将泥水混合物静置，取底部活性污泥测定氧化还原电位和污泥含水率，并提取dna进行pcr扩增。然后采用琼脂凝胶电泳检测，将得出的检测结果与已知的teta、teto、tetw长度进行对比，

筛选得到符合条件的基因后，采用刀片对凝胶上的基因条带进行切割，之后使用dna回收试剂盒进行纯化操作。

4. 研究创新点

(1)研究内容具有挑战性活性污泥中的四环素抗性基因是当下比较热门的研究领域，正逐渐得到越来越多的重视。该课题的系列研究，必将对解决环境中的抗生素污染，保证人类社会长远发展起到深远的影响。

(2)采用新思路解决问题采用传统工艺去除四环素抗性基因，都存在去除效果一般，去除条件较严苛等问题。不同于常规的厌氧消化、消毒等手段，本实验聚焦于重金属在四环素抗性基因削减中的作用。

(3) 手段先进

5. 研究计划与进展

1.3月10日前，完成开题报告，确定实验流程

2.3月15日左右开始实验

3.4月20日前，完成实验样品的采集、处理等主要部分，并进行中期检查