一株菲降解细菌的分离筛选及其成膜能力和降解特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一 研究意义

多环芳烃(pahs)具有致癌性和致突变性,对人类健康和生态环境存在很大的危害,已经引起世界各国的普遍重视，同时它也是我国土壤环境中多见的一类重要有机污染物,污染面广,污染强度呈增大的趋势。自从20世纪60年代首次发现一株土壤假单胞菌(pseudomonasspp.)对pahs的降解作用后，微生物修复成为清除pahs污染的最有效的手段^[1]。

土壤中的pahs通过植物进入食物链，最终危害人体健康，而根系是植物吸收土壤中有机污染物的一个主要途径。自然条件下，大多数根际细菌可通过成膜作用在植物根表形细菌生物膜^[2]，以协助植物抵抗外界的不良环境或促进植物生长^[3]。有机污染物在被植物根系吸收的过程中，多需经过根表细菌生物膜这一特殊界面。但至今为止，具有有机污染物降解功能的根际细菌在根表的成膜作用及其对植物吸收有机污染物的影响尚不清楚。而菲具有独特的化学结构,成为pahs研究的模式化合物,菲污染的研究不仅有利于污染环境中菲的去除,还可为pahs污染的防治提供有价值的资料。

2. 研究的基本内容和问题

一 研究目标

分离、筛选出1株具有菲降解功能的成膜细菌，弄清其成膜能力。

二 研究内容

3. 研究的方法与方案

一 研究方法

筛选细菌拟采取富集培养和划线纯化等方法；再利用高效液相色谱等检测菌株对菲的降解能力，最后通过结晶紫染色检测细菌的成膜能力。

二 技术路线

三 实验方案

以菲为主要碳源和能源对植物根表土壤中的细菌进行富集培养，筛选具有菲降解功能的细菌。具体过程是：在典型PAHs污染土壤上，采集看麦娘的植物样品，取其根表土壤2克左右，加入到以菲为主要碳源的无机盐培养基中，于28℃以150rpm 震荡培养，每7d 转接一次，转接四次后将富集液梯度稀释并涂布以菲为主要碳源的基础盐琼脂平板，于28℃培养。待平板上长出菌落后，用平板划线法进一步分离纯化。获得纯化菌株后，进一步利用高效液相色谱等检测手段验证各菌株对菲的降解能力，详细操作参照文献方法进行（Sheng et al, Int Biodeter Biodegr,2008）。

获得菲降解细菌后，再利用菌落形态观察、液体静置培养和结晶紫染色等方法从中筛选成膜能力较好的细菌菌株。观察细菌在固体平板上的菌落形态是否呈现生物膜特征，同时在液体静置培养条件下观察细菌是否发生成膜现象，而后利用结晶紫染色检测细菌的成膜能力，具体方法如下：将细菌的过夜培养物用无菌水稀释至OD600=0.3，按1%接种量将其接入含300ul 新鲜有氮培养基的1.5ml离心管中，扣紧管盖，于28℃培养24h 后，将形成的细菌生物膜移至一新的离心管，经无菌水漂洗后，加入400μl 0.1%（w/v）的结晶紫染液染色20min，弃去染液，再用无菌水漂洗两次后，将已被结晶紫着色的细菌生物膜溶解于500μl95%的乙醇中，于波长590nm 处检测吸光值(Yamaga et al, Environ Sci Technol, 2010)。

四 可行性分析

选题上，本项目在实验室前期工作的基础上，筛选具有菲降解功能的成膜细菌，有望丰富PAHs 降解功能菌库，并有助于深入地揭示PAHs 污染下根土界面上植物和微生物间的交互作用。选题上具有积极的现实意义和坚实的理论基础。

方法上，申请者导师熟练掌握了微生物群落结构分析、微生物分离培养鉴定、代谢产物检测、功能基因克隆表达以及荧光蛋白基因标记等技术和方法，为本项目的顺利开展提供了技术保证。

4. 研究创新点

本项目在实验室前期研究工作的基础上，从污染区植物根表土壤分离、筛选具有成膜能力的菲降解细菌，以探索其在植物根表的成膜作用，有望丰富PAHs降解功能菌库，并有助于深入地揭示PAHs污染下根土界面上植物和微生物间的交互作用，可为其它有机污染物功能菌的筛选所借鉴。

5. 研究计划与进展

2014年12月-2015年2月

分离、筛选出1株具有菲降解功能的成膜细菌并鉴定分类