稻田土壤有机砷去甲基化微生物 QY-1的分离筛选、鉴定及其去甲基化分子机制的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

砷（as）位于元素周期表第v主族，原子序数33，是一种剧毒的类金属元素，广泛分布于各种水体和土壤中。美国的环境保护署将其列为有毒有害物质表(http://www.atsdr.cdc.gov/spl/index.html )的首位。砷污染已经成为一个全球性的环境问题。砷的污染主要来源于两个方面：1、自然来源-包括岩石中伴生的砷，是影响全球砷循环的主要动力，它直接决定了土壤、大气和生物体内砷的含量和分布；2、人为的因素-人类生产和生活中排放的砷，例如：采矿（zhu et al.,2008.）、含砷农药的使用（wiliams et al.,2007.）以及高含砷量地下水进行农业灌溉（su et al,.2010）等很大程度上造成部分地区中土壤砷含量超标。水稻是人类主要的粮食作物之 一,然而,目前稻米主要生产区(东南亚地区)的土壤和灌溉水砷污染严重,导致稻米中砷的积累。砷在稻米中的积累通过食物链传递,对人体健康构成严重威胁。 所以，稻米砷污染问题已成为东南亚地区比较突出且急需解决的环境问题之一。稻田中砷的形态可以分为无机砷和有机砷两大类 （jia et al,.2012）。在一定的条件下，土壤中的砷能够在微生物的作用下进行形态的转化（islam.et al.2004;陈同斌.1996），会有单甲基砷（mma）、二甲基砷（dma）和三甲基砷（tma）的产生（杨婧等，2009）。无机砷[as(Ⅲ)和as(v)]可以通过微生物的甲基化作用转化为毒性较低的有机砷化合物，例如mas(v)、dmas(v)、tmas(v)o等。除了微生物的砷甲基化作用，有机砷类化合物还可能来自于含砷杀虫剂和除草剂的使用。另外，稻田土壤中的，有机砷类化合物也可逆向转化为无机砷化合物，这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程，砷的微生物甲基化和去甲基化过程是砷地球化学循环的重要组成部分。这一逆向过程称为有机砷的去甲基化过程。

目前为止已发现的具有有机砷去甲基化能力的微生物比较少，仅有几例：从有机砷污染的高尔夫球场土壤中分离的两株具有有机砷转化能力的微生物burkholderia sp.mr1 和streptomyces sp.md1，前者可以将mas（v）还原为mas（Ⅲ）而后者会利用前者的转化产物，将其进一步去甲基化生成mas(iii) ；并在佛罗里达的高尔夫球场土壤出分离出具有mas(iii)去甲基化能力的杆菌bacillus sp. md1，克隆其具有mas(iii)去甲基化能力的砷可诱导基因（arsi），其基因产物arsi，是非血红素铁依赖双加氧酶与cas裂解酶而产生酶活性（masafumi yoshinaga1 and barry p. rosen， 2014）。

稻田中同样也发现了上述类似的有机砷矿化过程，并且也有研究报道在该过程中微生物起到了非常重要的作用。然而，到目前为止，研究人员并未能从稻田中分离鉴定到这些微生物，本研究从稻田中分离到了一株具有有机砷[mas(v)] 矿化能力的微生物qy-1，并对其为什么具有这种能力的分子机制进行初步的阐释。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标：

本研究首次计划从稻田中分离出有机砷去甲基化的原菌，克隆并鉴定与mas（Ⅲ）去甲基化相关的关键基因，并对其功能进行详细阐述。最后将其基因导入拟南芥中，并使其基因表达，从而让拟南芥发挥去矿化作用。

2.研究内容：

3. 研究的方法与方案

一． 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1. 研究方法：

本实验是通过对郴州、祁阳水稻土进行培养，找出具有去甲基化作用的原菌，找出与arsi的同源基因，克隆鉴定导入大肠杆菌，使其基因表达，最后监测其抗性。

4. 研究创新点

一． 特色或创新之处

本研究首次计划从稻田中分离出有机砷去甲基化的原菌，克隆并鉴定与MAS（Ⅲ）去甲基化相关的关键基因，并对其功能进行详细阐述。最后将其基因导入拟南芥中，并使其基因表达，从而让拟南芥发挥去甲基化作用。

5. 研究计划与进展

2015.112016.1 将郴州、祁阳采集的土壤样品分批风干、过筛(2mm和100目)。

2016.2.232016.3.15 郴州、祁阳的土壤富集培养、稀释涂布、挑单菌落、功能验证、菌种保存

2016.3.172016.3.20找出与arsi的同源基因； arsi基因的克隆与功能鉴定；arsi的抗性试验；整理并进行数据分析