内生菌Chitinophaga sp. PRd7降解多环芳烃特性开题报告

全文总字数：8715字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

多环芳烃（pahs）是污染土壤中常见的持久性有机污染物（pops），具有致畸、致癌、致突变的效应（三致效应）。自然界中，土壤及水环境中的pahs可通过植物吸收积累，再由生物链传递而危害人体健康和生态安全。因此寻求有效方法来去除污染区植物体内pahs，降低植物有机污染风险、保障农产品安全、实现污染土壤的资源化至关重要。目前，利用具有pahs降解功能的植物内生细菌来治理pahs污染已成为研究热点。然而，关于从受pahs污染的健康植物体内筛选出具有pahs降解功能的内生细菌，并重新定殖到目标植物体内，以降低土壤和植物体内pahs污染水平的研究仍很薄弱。

目前，利用具有pahs降解功能的植物内生细菌与植物来联合治理土壤和植物pahs污染已成为土壤环境领域的研究热点。植物内生细菌是一类定殖于健康植物组织内，并与寄主植物和谐联合的微生物，主要表现为促进植物生长、提高植物抗逆性、降低植物病虫害发生等^[1,2,3]。陈小兵等^[4]从石油污染土壤的水花生（alternanthera philoxeroides）体内分离筛选出具有菲降解功能的内生肠杆菌（enterobacter）7j2，抗药性标记后能良好定殖于小麦（triticum aestivum）体内，并能促进小麦生长，更能增强小麦对土壤中菲的去除率。sun等^[5]从pahs污染厂区的看麦娘（alopecurus aequalis）体内分离筛选出具有芘降解功能的内生葡萄球菌（staphylococcus）bj06，抗性标记后能有效定殖于黑麦草（lolium perenne）体内，并能增强土壤中芘的去除率，降低植物pahs污染风险。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

用已筛选的功能性内生菌肠杆菌属prd5，初步建立其在植物中定殖方法，并证实其定殖可降低植物pahs污染和环境中的pahs残留。选择主要芘降解酶，分析功能内生菌降解芘的效果。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法：浸种实验，水培植物，短时高效。

2.技术路线：

1.实验方案：

A.菌悬液的制备

将菌株PRd5接种到新鲜LB抗性培养基中150 r·min-1、30℃摇床培养5 h，6000 r·min^-1离心10 min，弃去上清液，加入无菌水使菌体混合均匀，再次离心，洗涤2~3次，最后用无菌水调整菌悬液的OD₆₀₀nm值为1.3(菌落数约为8.77 lg CFU·mL^-1)，4℃保存备用。

B.芘污染霍格兰营养液

芘溶解于丙酮后，均匀加入到半强度霍格兰营养液中，调节pH=6.0±0.2。待丙酮挥发后，充分搅拌、混匀，并用未污染营养液稀释，制得芘浓度为0.1 mg·L^-1和0.5 mg·L^-1的污染培养液。共分为3个浓度（0、0.1、0.5），每组设3个平行。

C.浸种接种

i.种子表面消毒、催芽、育苗60h后用菌悬液浸泡6h，置于1/5强度霍格兰营养液（其中加入微量元素）中，培养至株高约10cm（约7d）。

不接菌组用无菌水处理。

ii.选择长势相同的菌株进行移苗，移入含有不同芘浓度霍格兰营养液的棕色广口瓶中（每瓶250ml溶液，种植12棵植物）。置于恒温箱中（昼夜25/20℃，培养4d进行测定。每个处理重复3次。

实验设置处理组如下（15组）：

表示加菌，-表示不加菌

D.植物体内功能内生细菌定植效率

植物表面灭菌：用超纯水清洗植物表面，将植物样置于滤纸上吸除表面水分，最后用剪刀将植物根和茎叶分离，用分析天平分别称取植物根和茎叶的鲜重，然后置于无菌操作台内依次用75%乙醇漂洗3min，无菌水冲洗3次，0.1%NaClO清洗3min，再用无菌水冲洗。将消毒的植物移入LB固体平板中30℃培养72 h，检查表面是否有残留微生物。

将消毒的植物置于灭菌研钵，用无菌水研磨均匀。吸取上清液稀释涂布于MSM抗性固体平板，30℃恒温培养48 h，计算细菌菌落数，每个处理设置3个重复。回收的菌株通过菌落形态来确定其是否为接种菌株。

E.植物体内生物量的测定

植物样品采集完毕，将植物样品根部与茎叶分离，然后用超纯水淋洗干净，滤纸擦浸干植物表面水分，并分别测植物样品根部、茎叶的鲜重。将新鲜植物冷冻干燥3 d后，测定植物样品的干重。

F.植物体内芘的提取与测定

冷冻干燥后的黑麦草根和茎叶，充分研磨粉碎，然后称取一定量植物样品于30 mL玻璃离心管中，再加入10 mL正己烷和二氯甲烷(V：V=1：1)的溶液超声萃取30 min，重复3次。

将全部萃取液过无水硫酸钠柱-硅胶柱净化，用11mL的二氯甲烷和正己烷(V：V=1：1)混合液洗脱。

将旋转烧瓶中洗脱液于40℃恒温旋转浓缩至干，加甲醇定容至2 mL，0.22 μm孔径滤膜过滤，选用HPLC法测定植物茎叶和根中芘含量，并计算芘浓度（mg·kg^-1）、芘积累量（μg/12株）、植物体内富集系数与传导系数。

植物体内芘积累量（Accumulation, A）的计算公式：A=Cp×M，其中Cp表示植物体内芘的浓度（mg·kg^-1），M表示植物干重（mg/12株）；

植物体内芘富集系数（Plant concentration factor,PCF）的计算公式：PCF=Cp／Cs，其中Cp表示植物体内芘的浓度，Cs表示水中芘的浓度（mg·L^-1）；其数值反映的是黑麦草对污染物富集能力的强弱，其富集系数越大，富集能力越强。

植物体内芘传导系数（Translocation factor,TF）的计算公式：TF=SCF／RCF，其中SCF表示芘在植物地上部位的富集系数，RCF表示芘在植物根中的富集系数；TF值越大，污染物从根系运输向茎叶传导能力越强。

菌株的促进效率（Enhancement ratio,E,%）的计算公式：E%=（CCP-CCPB）×100/CCP，其中CCP表示未接种功能菌株的植物体内芘的浓度，CCPB表示接种功能菌株的植物体内芘的浓度。

为了检验方法的准确度，采用之前黑麦草样品前处理方法和分析条件，确定植物放入样品的芘本底(空白对照)，同时取定量上述样品，分别加入芘标准液，暗处静置，待甲醇挥发后，测芘方法回收率。

G.培养液中芘的提取与测定

吸取3 mL培养液于离心管中，加入6mL甲醇，超声萃取30 min，过0.22 μm孔径滤膜，采用高效液相色谱（HPLC）测定培养液中芘含量（mg·L^-1），并计算其去除率。

为了检验方法的准确度，采用之前培养液前处理方法和分析条件，确定培养液样品的芘本底(空白对照)，同时取定量上述样品，分别加入芘标准液，暗处静置，待甲醇挥发后，测芘方法回收率。

H.植物体内酶活的测定

i.邻苯二酚-2, 3-双加氧酶(C23O)的提取及测定

称取植株地上和地下部分各0.1g，加入PVP（聚乙烯吡络烷酮）0.05g和pH=7.5的磷酸缓冲液（PBS）3mL，冰浴研磨，后放入冰浴中超声破碎，4℃冷冻离心（12000 r·min^-1、30 min），取上清液(粗酶液)。

C23O酶活力测定：采用分光光度法，测定总体积为10 ml，分别向玻璃比色杯中加入缓冲液8ml，1.0 mL 20 μmol·L^-1邻苯二酚溶液，粗酶液1.0 ml。混匀后，30℃水浴反应，记录反应初始时OD375 nm，反应到3 min后，每隔0.5min测定溶液在该波长的光吸收值。

ii.植物多酚氧化酶（PPO）的提取与测定

称取植株地上和地下部分各0.1g，加入PVP（聚乙烯吡络烷酮）0.05g和pH=7.8的磷酸缓冲液（PBS）3mL，冰浴研磨，于10000 r·min^-1离心10 min，取上清液为粗酶液。以上操作均在4℃下进行。

依次向比色管中加入0.01mol·L^-1，2mL pH=6.0磷酸盐缓冲液（PBS），1.0mL 0.1mol·L^–1邻苯二酚，0.2mL粗酶液。反应介质摇匀，在420nm波长下比色测定。酶液加入后开始计时，每30s记录一次吸光度OD值，共记录6次3min。3组平行实验，酶活性是以每分钟OD值每增加0.01计为一个活力单位。则PPO酶活性（U/g）=△A×D/（0.01W×t），式中△A代表反应时间内吸光度变化，W代表鲜重（g），t代表反应时间，D代表提取总酶液为反应系统内酶液体积的倍数。

4. 可行性分析：

实验室条件完备，相关器械学校内均有配备；我本人具有一定环境工程微生物及有机化学的理论学习基础，且有过SRT的相关研究经历，对研究芘性质及其降解有一定的帮助。

4. 研究创新点

过去研究中多为土壤根际微生物对pahs污染的影响，关于植物内生细菌定植于植物体内对pahs降解作用的报道则相对较少。

通过对功能植物内生细菌prd5在菠菜和上海青体内定殖特性的研究，揭示菌株定殖后在植物体内的转移和分布及不同定殖方式对植物及土壤中芘残留的影响。

研究结果对植物功能内生细菌定殖提供技术和数据参考。

5. 研究计划与进展

1.研究计划：

2019年1月1日—2019年3月5日基础理论知识学习

2019年3月6日—2019年4月30日实验操作及分析