除草剂三氟羧草醚降解菌的筛选及降解特性研究开题报告

全文总字数：4581字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题的意义

三氟羧草醚是一种典型的二苯醚类除草剂，三氟羧草醚选择性广谱芽前芽后除草剂，广泛应用于大豆、花生、小麦及水稻田一年生单、双子叶等作物的杂草，由于其水溶性强，自然光照下的半衰期为30~60d，可以在水中或土壤中残留很长时间，在使用过程中，易随地表径流进入河流、湖泊等水体乃至地下水中，长期施用会使环境中的三氟羧草醚不断的积累，对环境造成了潜在危害。微生物通过自身生命活动来分解代谢农药的污染物，而研究微生物的代谢机理对受污染的环境的生物修复起着至关重要的作用。本研究从农药厂的活性污泥池中利用富集分离和稀释涂布技术分离出一株能够高效降解三氟羧草醚的菌株，并且研究了该菌株的生长特性，降解特性以及菌株对三氟羧草醚的代谢途径，以期为三氟羧草醚在土壤环境中的降解规律以及受三氟羧草醚污染的土壤修复研究提供科学依据。

目前，关于三氟羧草醚的微生物降解的报道很少，因此，能够分离出降解三氟羧草醚的高效降解菌必然会对含有三氟羧草醚的工业废水和被三氟羧草醚污染的土壤修复带来促进作用。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

通过实验总结出提取富集三氟羧草醚降解菌的方法，以及探索出降解菌的降解特性。

研究的内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

(1)实验法：研究并设计实验、进行实际操作得到数据、对数据进行处理及分析、得出实验结论及结果。

(2)参考文献法（辅助）：通过查阅资料及文献，结合实验操作，对实验中存在的问题进行补充说明，必要时可调整实验计划，辅助完成实验操作。

技术路线

实验方案

原理：从生产三氟羧草醚的农药厂的污水处理站活性污泥中驯化、 分离筛选得到一株三氟羧草醚降解菌DK-3，并且观察研究该降解菌的生长特性、形态特征和生理生化特以及结合菌株16rRNA序列对菌株进行鉴定，以期为菌株DK-3的后面的降解特性研究和联合固定化应用提供一定的理论依据。

实验因子选定：影响其产生的因素有很多，包括纳米Fe₃O₄浓度、金属离子、 温度、 起始pH、氯化钠浓度等等。根据反应原理，本实验对联合固定化菌体降解三氟羧草醚影响的各个方面展开研究，综合实验现象及数据得出结论。

验证结论：对实验结论进行验证，总结问题。

三氟羧草醚的测定

取待测的三氟羧草醚的无机盐液体培养基，在摇瓶中加等量的二氯甲烷充分 振荡30 min，待水相和有机相静止分层后，用移液管吸取1mL有机相，加无水 硫酸钠到过量吸收残留的水分，待二氯甲烷吹干，加等量的甲烷重新溶。样品经

0.22μm有机滤膜过滤后，用HPLC测定其含量。

菌种制备和菌株生长量(OD_600nm)的测定方法

种子液的制备:将菌株DK-3接种于LB固体培养基平板上，放在30°C恒温 箱中培养24 h，从LB平板上挑取单菌落，接种到LB液体培养基中，于30°C、160 rpm摇床振荡培养至对数期( OD_600nm= 1. 2)，9000 rpm离心3 min后收集菌 体，用PBS缓冲液洗涤菌体，离心3 min，重复2次，再重悬于等体积的无菌水中作为种子液，备用。

降解菌株的富集与分离纯化

在三角瓶中加入5mL取自污水厂的活性污泥和含有100 mg·L^-1三氟羧草 醚的100mL无机盐液体培养基，将三角瓶放置在30°C、160 rpm条件下振荡培 养，每隔7d按5%接种量转接到新的含有100 mg·L^-1三氟羧草醚的无机盐液体 培养基中，连续转接5次后，通过HPLC测定三氟羧草醚的浓度，富集的无机盐 液体培养基中三氟羧草醚的降解率达到90%以上。

从摇瓶中取1mL富集液用无菌水稀释，分别稀释到10-2~10-6五个梯度，然 后取每个梯度的液体0.2mL分别涂布在含有200mg·L^-1三氟羧草醚的无机盐固 体培养基平板上，在30°C条件下培养，选择平板上不同形态、大小和颜色的单 菌落分别挑取在新的平板上划线纯化。将纯化后的菌株接种到含有100mg·L^-1三氟羧草醚的无机盐液体培养基中，于30°C、160 rpm摇床振荡培养5 d，通过HPLC测定三氟羧草醚的浓度。

菌株DK-3以三氟羧草醚为碳源的生长降解曲线

将种子液接入含有三氟羧草醚的无机盐液体培养基中，接种量为5%，三氟 羧草醚的初始浓度为100 mg·L^-1，在30°C，160 rpm条件下培养。以未加菌的 含有三氟羧草醚的无机盐培养基为对照。每隔12 h取样，测定样品中三氟羧草 醚的浓度。通过测定OD600nm来确定菌株DK-3的生长量。

环境因素对菌株降解三氟羧草醚的影响

(1)温度影响

按5%的接种量将种子液加入到100 mL含有三氟羧草醚的无机盐培养基中， 三氟羧草醚的初始浓度为100 mg·L^-1，设定温度为分别15、20、25、30、35和40°C，每个处理重复三次。将培养基放置在160 rpm摇床培养120h后取样，测 定培养基中三氟羧草醚的浓度，计算其降解率。

(2)初始pH值的影响

将含有三氟羧草醚的无机盐液体培养基的pH分别调至分至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，按5%的接种量加入种子液，三氟羧草醚的初始浓度为100 mg·L^-1。空白对照组为不加菌的含有三氟羧草醚浓度相同的无机盐培养基。将 培养基放置在30°C、160 rpm摇床培养120 h后取样，测定培养基中三氟羧草醚 的浓度，计算其降解率，每个处理重复三次。

(3)初始浓度的影响

无机盐培养基中三氟羧草醚的浓度分别为20、60、100、200和400 mg·L^-1，初始pH为7.0，按5%接种量加入种子液，其他条件同上，测定培养基中三氟羧草醚的浓度，计算其降解率。

(4)接种量的影响

在含有100 mg·L^-1三氟羧草醚的无机盐培养基中，分别按1%、3%、5%、10%和15%的接种量接入种子液，初始pH为7.0，其他条件同上，测定培养基中三氟羧草醚的浓度，计算其降解率。

(5)金属离子对三氟羧草醚降解的影响

分别向无机盐培养基中添加重金属离子Cd² 、Ba² 、Co² 、Pb² 、Fe³ 、Zn² 、Cu² 、Ag ，每种离子浓度分别为0.1mmol·L^-1和1.0 mmol·L^-1，三氟羧草醚的初始 浓度为100 mg·L^-1，初始pH为7.0，按5%接种量加入种子液，其他条件同上， 测定培养基中三氟羧草醚的浓度，计算其降解率。

可行性分析

首先，本项目主要在南京农业大学资源与环境科学学院水污染控制实验室及环境微生物实验室进行。实验室拥有紫外可见分光光度计、高效液相色谱仪、超净工作台、恒温摇床、马弗炉、烘箱等多种先进实验仪器设备，为本项目中的实验提供有力支持。其次，本人查阅了大量的相关文献，已具备一定的理论基础，必要时还可查阅图书馆中的大量资料，对完成实验起到辅助作用。最后，指导老师设计经验丰富，治学严谨，对于实验进度以及实验过程中的问题可提供及时有效的指导和帮助。

4. 研究创新点

目前国内外关于三氟羧草醚的微生物降解的研究报道很少。本研究从生产三氟羧草醚的农药厂活性污泥池中污泥中分离出一株能够降解三氟羧草醚菌株，该菌株被命名为DK-3，初步鉴定为香茅醇假单胞菌。

通过HPLC-MS分析，确定菌株降解三氟羧草醚的中间代谢产物，推测其降解途径，分析其降解机理;采用新型海藻酸钠—纳米Fe₃O₄联合固定化技术对菌株DK-3进行固定化，研究该固定化菌在在不同环境条件下的降解特性及其工程化应用，为以后三氟羧草醚的生态修复提供理论依据。

5. 研究计划与进展

(1)前期准备（3月2日至3月上旬）

查询资料及相关文献，了解项目相关实验背景及国内外研究近况，完成文献资料整理，实验初步设计以及开题报告的撰写。

(2)实验操作及数据处理（3月上旬至4月中旬)