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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题意义
超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,简称SOD)在需氧原核生物和真核生物中广泛存在, 是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶。植物正常代谢过程和在各种环境胁迫下均能产生活性氧和自由基,活性氧和自由基的积累引起细胞结构和功能的破坏。SOD岐化超氧物阴离子自由基生成过氧化氢和分子氧,在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用。SOD是生物体防御氧化损伤的金属酶，具有治疗炎症、抗辐射损伤、防癌、抗衰老等广泛药用前景。另外在植物抗逆和生物固氮等方面也有重要作用。生物体在新陈代谢过程不断产生大量的自由基,并进行自由基反 应,体内必须有相应的保护机体不受自由基损伤的系统,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)就是保护系统中的一个重要成员。本课题的主要内容就是筛选出产生SOD的菌株并鉴定出它的抗生素敏感性、对SQR、CK02、放线菌的拮抗作用。
2.应用前景
早在本世纪初对自由基反应就已有研究，1939年,SOD蛋白就由Man和Keilin从牛血球细胞中提取,50年代又从人的红血球、大脑、牛和马的肝脏中发现了类似的蛋白,但对其功能一直不了解，还只局限在辐射生物学的范围内，人们还没有认识到正常生物体内自由基反应的重要性,60年代末,超氧化物歧化酶的发现,使生物体内自由基的研究,特别是氧自由基的研究成为一个活跃的领域,1969年,美国的Mc Cord和Fridovich从牛血球细胞中提取出这种蛋白,发现其功能是催化超氧自由基的歧化反应,产生毒性较小的过氧化氢和氧气。
现巳认识到在生物体正常的物质代谢过程中,自由基产生与清除的平衡对生物体起着重要作用,这一平衡的紊乱将导致生物产生疾病、 衰老甚至死亡。SOD的主要功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，产生的超氧阴离子自由基是生物体内正常的代谢产物。但是自由基的积累将使细胞膜的脂质发生过氧化作用而引起膜裂变，导致细胞损伤甚至死亡。SOD是生物体内最重要的且最佳的自由基清除剂，维持机体代谢平衡。SOD作为超氧阴离子自由基清除剂主要在延缓人体衰老、预防疾病、改善人体免疫力、作为食品及化妆品添加剂方面有极为广泛的应用。SOD作为第一个以超氧阴离子为其作用底物的酶被发现以来，已充分证明了其在防治与超氧自由基有关疾病方面的有效作用。当机体超氧阴离子产生过多或SOD浓度偏低时，过量的超氧阴离子就会引起疾病，给以外源性SOD即可有效地予以防治。
3.国内外研究进展
四川大学的王忠彦、黄英等人从实验室里保藏的十几株耐高温细菌中筛选鉴定出SOD产生菌，并对其酶的稳定性和酶学特性做了相关研究。其中对酶学特性的研究包括热稳定性、耐酸碱性、蛋白酶耐受性、抑制剂对酶活力的影响以及存放稳定性。他们将所有菌株活化,于55℃液体培养,选择生长良好的菌株进行H2O2抗性筛选。选得能抗0.3% H202的菌株三株, 即211-9、11-17和211-15。摇瓶培养收集菌体超声波破碎后直接测上清液酶活。三株菌生物量相差不大,但SOD含量不一。挑取耐0.4%H2O2的211-15平板菌落,摇瓶培养后测其细胞SOD含量,发现酶活明显升高,达8774 u/g细胞,比处理前提高约12%。取S0D含量为8774u/g细胞的上述211-15号单菌落,作为筛选得到的耐高温SOD产生菌。采用12项生理生化特性与形态观察相结合的方法，鉴定筛选得到的211-15号菌株为嗜热脂肪芽孢杆菌。
酶活特性：
温度对SOD活性的影响
PH（A）和蛋白酶（B）对SOD活性的影响
抑制剂对SOD活性的影响
参考文献
[1] 袁勤生，王志友，翁清清，等.中国药学杂志，1989, 24(7): 387~395.
[2] Pappo A, Rigand J. FEBS Letters,1986,21: 187~ 189, 201.
[3] McCord J M, Fridovich I.J Biol chem,1969, 244: 6049.
[4] Brehm J K et al. APPI MicrobiolBiotechnol, 1991, 36: 358~ 363.
[5] 张纪忠.微生物分类学.上海:复旦大学出版社，1990.
[6] 布坎南R E,吉本斯N E,等(中国科学院微生物研究所译).伯杰细菌鉴定手册(第八版).北京:科学出版社，1984. 733~744.
[7] 方允中，李文杰.自由基与酶.北京:科学出版社，1989. 71~108.
[8] 邓碧玉，袁晴生，李文杰，等.生物化学与生物物理进展，1991，18(2): 163.
[9] 静天玉，赵晓瑜.生物化学与生物物理进展，1995， 22(1): 84~86.
[I0] Bradford M M. Anal Biochem, 1976, 72:248.
[11] Chris B C. Jounal of Bacteriology,1990, 172: 1539~ 1546.
[12] Olivia B M. Proc Natl Acad Sci USA,1988, 85: 4789~ 4793.
[13] 陈瑗，周玫.生命的化学，1994, 14(6): 3~5.
[14] Lumsden J et al. BiochemBiophysActa, 1976, 438: 380.
[15] 王忠彦，黄英，胡永松，胡佩.一株耐高温SOD产生菌的筛选及酶学特性,微生物学报. 37(4):307~311,1997.
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
1.sod产生菌的筛选
2.分离出纯种菌株，进行抗生素敏感性鉴定
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1. 研究方法
细菌培养基：种子培养基为 LB培养基,发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。55℃通气培养。H2O2抗性试验：菌种培养至对数期,加H2O2至终浓度0.1%～5.0% ,继续培养至稳定期 ,取0.1mL直接涂平板计数。SOD酶活测定：邻苯三酚法。拮抗性测定：平板对峙法。
2.技术路线
| 撰写开题报告 |
| 查阅相关文献 |
| 完成SOD产生菌筛选 |
| 进行H2O2抗性测定 |
| 鉴定SOD产生菌对SQR9、ck02、放线菌拮抗作用 |
| SOD产生菌对C源利用结果 |
一、筛菌：
取菌粉少量，于4ml离心管，加无菌水，震荡30min,,按梯度稀释至10-9，取100ul涂布，每个3个重复。30℃培养2天，长出单菌落，划线培养2天。划出单菌落，液体NA60%甘油保存。
二、H2O2耐受试验：
1、种子培养基:LB培养基。
2、发酵培养基:肉汤蛋白胨培养基。
生理生化反应培养基:半固体肉汤蛋白胨培养基；葡萄糖蛋白胨培养基(M.R,V.P实 验)；糖发酵培养基；蛋白胨液体培养基；淀粉水解培养基；叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基。
3、试剂SOD (牛血), 为上海东风试剂厂产品；溶菌酶,链霉素硫酸盐，为上海生化制 品研究所产品；邻苯三酚为国产分析纯；蛋白酶E为美国sigma公司产品。4、从H2O2抗性筛选菌种培养至对数生长期加H2O2至终浓度0.1%-0.5%, 继续培养2-3h,取 0.lml直接涂平板计数。
4、细菌培养基：种子培养基为 LB培养基,发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,30℃，170r培养。每株菌接种LB摇瓶培养至12h作为种子液，接种10%种子液至NA液体培养基，摇瓶培养12h。加H2O2至终浓度0.1%～0.5% ,继续培养2.5h ,取100ul直接涂平板计数，每个梯度3个重复。
三、酶活测定：
1、热稳定性 粗酶液在25～85℃范围内保温15min后置冰浴 ,测残存SOD活力的结果。
2、pH稳定性 巴比妥广泛缓冲液与酶液等量混合,25℃保温30min,测酶活
3、蛋白酶耐受性 酶液中加入蛋白酶E至终浓度0.1mg/mL和1mg/mL,37℃保温0～60min,测残存SOD活力。
4、存放稳定性 酶液加等量无菌甘油分别于室温和 4℃贮存 ,每半月测酶活一次。
四、平板对峙法：将SOD产生菌和SOQ9、ck02、放线菌分组分别在培养皿培养，共同培养一段时间后，查看抑菌圈大小来判断拮抗效果。4. 研究创新点
超氧化物歧化酶(sod)是以o2为底物的金属酶 ,它广泛存在于生物界，是体内氧自由基解毒系统的一个关键酶,在医药、食品、化妆品、农业方面有着广阔的应用前景，因此受到国内外普遍重视。
国内对于sod的研究所用材料多偏重于动、植物的sod,而关于微生物sod的研究报道不多。
我们通过对耐高温sod产生菌的产酶情况展开研究，探究它的多项酶活特性。
5. 研究计划与进展
1月01日——3月12日 查找资料，阅读相关文献；
3月12日——3月31日 实验室内进行实验，完成菌株筛选及部分特性鉴定工作；
4月01日——4月30日 完成中期进程汇报，接着进行后期实验；
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