细菌漆酶基因的异源胞外表达研究开题报告

1. 研究目的与意义

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，由于其底物范围广泛，能催化多种反应，能催化氧化多种芳香族化合物，在木质素矿化降解、腐殖质形成等过程中发挥重要作用，在纸浆的漂白、燃料脱色、果酒加工及生物传感器等领域具有广泛的应用前景。漆酶广泛存在于真菌和植物中，通过对蛋白质数据库和细菌基因组进行同源性搜索，推测漆酶也存在于细菌中。

漆酶的底物广泛性、底物在自然界中的难降解性与毒性以及漆酶反应的环境友好性使得漆酶有着极大的应用前景。目前所有的漆酶应用原理都是利用漆酶的氧化还原特性氧化有毒的芳香族化合物。漆酶已被广泛应用于纸浆造纸、污水处理、食品、有机合成等行业，此外漆酶在环境修复、服装行业、毒品检测和生物传感器方面也有相应的研究报道。

2. 国内外研究现状分析

从1983年起，人们陆续在生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)、交替单胞菌Alteromonassp.MMB-1、大肠杆菌Escherichia.coli、假单胞菌Pseudomonassp.KU03、粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens、球形芽孢杆菌Bacillussphaericus、极端耐碱芽孢杆菌Bacillushalodurans和链霉菌属的Streptomycescyaneus、天蓝色链霉菌S.coelicolor及S.psammoticus等一些菌株中发现有活性。细菌漆酶能够氧化典型的漆酶底物，与真菌漆酶相比，细菌漆酶具有无糖基化、在含卤素和碱性的环境中稳定及细菌生长速度快的优点。

目前，研究比较深入的细菌漆酶是枯草芽孢杆菌（Bacillushalodurans）芽孢外衣蛋白CotA。Driks推测CotA分子质量约为65ka，具有laccase-like活性，并参与合成类似黑色素的孢子色素。Martins等也对CotA进行研究，认为CotA可能起到抗紫外线和抗氧化的功能，并发现CotA蛋白与多铜氧化酶在结构具有相似。由于芽孢本身特殊构造，使内含芽孢的微生物可以在极其恶劣的环境下生存，因此，芽孢外衣蛋白就可能在高温或高pH的条件下不失活，而这种特性优势正是工业应用所急需的。Held等发现BacillusSF的芽孢外衣蛋白就有laccase-like活性，利用芽孢的耐高温、高PH的特性，设计了游离漆酶与芽孢漆酶热稳定性、pH稳定性的对比试验，结果表明，游离漆酶在60℃和pH8.0的条件下，半衰期仅为5分钟，而芽孢漆酶却可以在同一条件下稳定存活，半衰期达到66h.这一结果比Abadulla等报道真菌漆酶热稳定性的11.5h和等报道的3h分别高了6倍和20倍。

3. 研究的基本内容与计划

细菌漆酶菌株的筛选与鉴定，细菌漆酶菌株生物学特性及酶学性质研究

温度、PH、金属离子、抑制剂、有机溶剂、染色剂对细菌漆阵活性影晌，用分光光度计测酶活，作出生长曲线。

4. 研究创新点

不需要小分子介体物质的参与且降解效果较好,显示了本研究所采用的细菌漆酶在染料降解的应用上具有很大的工业应用潜力。