固定化漆酶降解水体中磺胺类抗生素的研究进展开题报告

1．本课题研究的背景、目的及意义

磺胺类抗生素（Sulfonamides，SAs）在医疗卫生、畜牧业及水产养殖业等领域中应用非常广泛，其在全世界抗生素总使用量中占有极大比重。磺胺类抗生素在人体和动物体内代谢不完全，会产生残留物，更多情况下会通过排泄物的形式转移到水体中。虽然水环境中磺胺类抗生素的残留浓度大多在ng/L~μg/L水平，但由于其在环境中不易发生降解，会长期存在并累积，进而造成其在畜禽粪便、土壤、水体、植物等环境介质中残留，对生态环境造成一定的危害，并通过食物链的富集，最终可能会危害人体健康。目前，国内外均有研究报道磺胺类抗生素在水体中的普遍残留现象。然而，国内污水处理工艺对抗生素类污染物的去除，存在去除率低，成本高等缺陷。因此，能否通过一种环保高效的方案以去除或降解水体中磺胺类抗生素显得非常必要。

漆酶（laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，具有强氧化还原性。漆酶作用的底物相当广泛，利用分子氧催化氧化自由基可以降解酚类和非酚类物质，且具有处理效率高、无二次污染和易操作等优点。正是因为漆酶作用的环保性、高效性和广谱性，它在水体的污染防治和控制中具有巨大的应用前景。由于游离态漆酶稳定性差，重复利用率低，生产成本高，限制了其在实际生产中的应用。酶固定化是目前克服这些局限性的最好方法，通过酶固定化技术将漆酶固载于载体表面，从而改善酶的稳定性和降解效率，延长使用寿命。载体是酶固定化的关键，优良的载体可有效提高漆酶的活性和可重复性。本研究采用磁性生物炭作为载体，生物炭是一种利用废弃的农作物及其他生物质材料经处理制得的新型环境功能材料，具有较大的比表面积和吸附容量，而磁性的固定化酶在反应液中可通过磁铁吸附方便回收，有利于节能省时，从而减少酶的应用成本。目前，将磁性生物炭作为酶固定化载体的报道还较少。

综上，本研究拟以农业固体废弃物茶籽壳进行处理，合成磁性生物炭，通过吸附-交联法将漆酶固载于磁性生物炭表面，制得固定化漆酶磁性生物炭材料。同时，考察固定化漆酶对磺胺类抗生素的降解能力，通过高效液相色谱（HPLC）监测分析，并讨论可能的去除机理，以期为漆酶固载化磁性生物炭处理水体中磺胺类抗生素提供理论基础。

2．本课题主要研究内容和预期目标

主要研究内容：

（1）探索磁性生物炭固定化漆酶的最优固定化条件，研究载体粒径、加酶量、吸附时间等因素对固定化漆酶酶活的影响，并利用扫描电镜和傅里叶红外光谱仪对磁性生物炭的理化性质进行表征。

（2）通过研究pH和温度对漆酶酶活的影响，找到固定化漆酶的最适作用pH、温度。

（3）分析固定化漆酶对水体中磺胺甲恶唑的去除机理，并利用高效液相色谱（HPLC）谱图分析磺胺甲恶唑的降解规律

（4）探究流动相的选择、流速的控制、柱温等色谱条件的影响，找到最佳仪器检测条件。

预期目标：

（1）确定漆酶最优固定化条件，使用扫描电镜和傅里叶红外光谱仪对上述合成出的材料进行表征，确定复合粒子的粒径、形态及表面基团。

（2）确定最适的pH、温度和最佳的检测仪器条件。

（3）通过高效液相色谱监测水体中磺胺甲恶唑的残留浓度，探究固定化漆酶对水中磺胺甲恶唑的去除机理。

（4）总结研究成果，完成学士学位论文。

3．本课题拟采用的研究方法、步骤

3.1 研究方法

3.1.1.建立了将漆酶固载于磁性生物炭表面，结合高效液相色谱法测定水体中残留的磺胺甲恶唑的分析方法。

3.1.2.试剂

本研究选用一种较易收集的农业废弃物：茶籽壳。漆酶取自云芝菌，由温州大学提供。

3.1.3.仪器

3.2 实验步骤：

3.2.1 微波法制备磁性生物炭

将茶籽壳用水洗涤除尘，在105°C下干燥3小时，然后放入粉碎机充分粉碎，然后用筛子筛得不同目数的茶籽壳粉末。将20g茶籽壳粉末与配置好的磷酸溶液按1:4的质量比浸泡24小时（放在磁力搅拌器上搅拌使浸泡充分），抽滤干净后放入鼓风干燥箱在105°C下干燥24小时，之后放入球磨仪中将颗粒研磨粉碎。将粉碎的颗粒与合适比例的Fe₃O₄混合均匀后放入微波合成萃取仪，在400W功率下加热40min，然后冷却。最后，将制得的材料用稀盐酸浸泡12小时，之后用纯水洗涤至pH为7左右，然后放入真空干燥箱在105°C下干燥12小时，获得磁性生物炭。

3.2.2 漆酶固定化

缓冲液的配制：琥珀酸钠缓冲液：称取 1g 氢氧化钠和 5.9g 琥珀酸，溶于超纯水中，用1mmol/L 氢氧化钠溶液调节 pH。

采用吸附-交联法进行漆酶的固定化，首先将磁性生物炭载体研磨、过筛，向 2g 载体中加入琥珀酸缓冲液和漆酶溶液，搅拌静置使漆酶充分吸附，再向体系中加入戊二醛溶液，慢速搅拌一段时间，静置、离心（3000r/min, 15min）、冲洗（去离子水）、抽滤，得到吸附-交联固定化漆酶。

3.2.3 材料的表征

（1）扫描电镜表征

取10mg左右漆酶固载化磁性生物炭样品分别平铺在不同的测试板上，并使之均匀较薄的覆盖粘在上面，因制得的样品导电性较差，在进行扫描电镜观察前，需在其表面真空镀金以增强其导电性。然后采用高分辨场发射扫描电子显微镜对其的微观结构和形貌特征进行表征，并在不同的放大倍数下拍摄照片，观察其形状、结构和表面性状。

（2）傅里叶红外光谱分析

本实验使用傅立叶变换红外光谱仪对漆酶固载化磁性生物炭进行红外光谱（FTIR）表征，方法是溴化钾压片法（KBr为光谱纯级别）。按照生物炭：KBr为1:100的比例制片，置于红外光谱仪中的测定窗口下进行检测，在4000~400cm^-1波长范围内以8cm^-1精度扫描20次获得傅里叶红外光谱图。

3.2.4 磺胺甲恶唑的去除

储备液的配制：用分析天平称取0.05g的磺胺甲恶唑至100mL烧杯中，加入50mL 0.01mol/L的NaOH溶液，用玻璃棒充分搅拌至其溶解。溶解完全后转移至1000mL容量瓶，用超纯水定容并摇匀，配制成质量浓度为50mg/L的磺胺甲恶唑溶液，将溶解好的储备液储存在棕色细口瓶中，放置在4°C冰箱内保存。

标准曲线的绘制：采用HPLC分析磺胺甲恶唑的浓度。用超纯水分别配制成质量浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10、15、20mg/L的磺胺甲恶唑标准系列溶液。对一定浓度梯度的溶液进行分析，得到其HPLC谱图。上述不同浓度溶液分别置于相应波长下测其吸光度，每个水样测三次，取平均值，绘制磺胺甲恶唑标准曲线，即可得吸光度（A）与磺胺甲恶唑质量浓度（c）的线性回归方程

通过高效液相色谱法（HPLC）监测水中SAs的残留浓度。称取6mg漆酶固载化磁性生物炭加到250ml具塞锥形瓶中，向瓶中加入100ml超纯水，并加入100μL一定浓度梯度的磺胺甲恶唑标准溶液，磁力搅拌使之与固定化漆酶充分接触混合，磁力搅拌20min。在磁搅萃取结束后，将磁铁置于样品瓶底部外侧，将上清液倾斜倒出。随后加入2m甲醇涡旋洗2min，用一次性注射器收集洗脱液，过0.22μm滤膜，转移至10mL离心管，如此重复洗脱两次。汇集后的洗脱液用氮气吹至近干，用1mL初始流动相回溶，取10μL进样。

4．本课题主要参考文献

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5．本课题的具体进度安排(包括序号、起迄日期、工作内容)