沙库巴曲缬沙坦钠中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量检测方法验证开题报告

1. 研究目的与意义

沙库巴曲缬沙坦钠(sacubitrilvalsartansodium)，是由novartispharmasteinag研究开发的抗心衰药物，在美国、欧盟等均有上市，商品名用于射血分数降低的慢性心力衰竭(nyhaⅱ-ⅳ级，lvef≤40％)成人患者，降低心血管死亡和心力衰竭住院的风险。沙库巴曲缬沙坦钠合成的起始物料的合成工艺中，有使用化合物b，化合物b结构中含有一个醛基，为基因毒性警示结构，为潜在基因毒性杂质，根据《遗传毒性杂质指导原则》，应对此杂质进行充分的质量研究，由于其终产物沙库巴曲缬沙坦钠有残留的可能，需在起始原料就要严格控制其限度。根据emea中《遗传毒性杂质限度指导原则》相关规定，其采用毒理学担忧阈值评价大部分药物的ttc值为遗传毒性杂质摄入量1.5μg/day，本品最大日剂量为0.4g，杂质b限度＝1.5μg/0.4g＝3.75ppm，在常规的hplc色谱条件下，杂质b在此限度浓度中，响应较低，不能完成方法学验证及样品检测,目前尚未有文献报道该潜在基因毒性杂质的检测方法。因此，找到一种灵敏度高、专属性好的检测该潜在基因毒杂质的方法，实现对沙库巴曲缬沙坦钠中杂质的有效控制，从而在一定程度上保证沙库巴曲缬沙坦钠的质量和患者用药的安全性，具有重要的研究意义。

2. 课题关键问题和重难点

由于 NDMA和NDEA 相对分子质量较小，在采用三重四极杆质谱检测时，可能会遇到噪声干扰大、仪器响应低、峰形差等问题。为了解决这些问题，对流动相、离子源、源参数等进行优化，采用添加 0.1% 甲酸的质谱级甲醇为流动相，APCI 源作为离子源，离子源温度：350℃；Collision Gas: Medium；Curtain Gas：35 psi；Nebulizer Current: 3.0 mA；Ion Source Gas1：35 psi；，最终实现了药物中 NDMA 的检测。在采用其他品牌的质谱仪时该优化方案也可作为参考。 LC-MS/MS 方法是目前常用的分析检测方法之一，无需高温加热样品，专属性高，重复性强。 LC-MS/MS 方法通过方法学验证，能够替代 FDA 的 LC-HRMS 方法，普适性更强，解决了各研究单位的燃眉之急，也为检验机构和药企提供了技术支持。本方法对实验操作人员的技术水平也有一定的要求。

3. 国内外研究现状（文献综述）

n- 亚硝基化合物是一类很强的化学致癌性物质， 包括亚硝胺和亚硝酰胺两大类物质，通常泛称为亚硝胺。超过300多种n-亚硝基化合物在一种或多种动物身 上显示出具有致癌作用，并且40多种动物包括灵长类 都是易于感染n-亚硝基化合物而引起癌症，而且这类强致癌物质在实验动物身上诱导的肿瘤在形态学特点上和在生化特点上都与相应的人器官上发现的肿瘤相似， 并且更多的实验和一些流行病学数据表明：人类是n-亚硝基化合物引起癌症的易感群体。

目前提取 ＮＤＭＡ和其它亚硝胺的方法典型的有液 －液 提取和固相萃取。这些方法的缺点是需要大量的样品、 污染环境的溶剂、提取和浓缩必需的时间。通常采用气相色 谱／质谱 （ＧＣ／ＭＳ）、气相色谱／热能分析仪 （ＧＣ／ＴＥＡ）、气相色谱／质谱／质谱 （ＧＣ／ＣＩ／ＭＳ／ＭＳ）进行检测，虽然热能分析仪具有很好的重现性，但由于热能分析仪应用范围较窄。一般实验室很少配备ＧＣ／ＭＳ在一般实验室也很少配备，因此需要寻找前处理方法简单易行且一般分析实验室常规仪器设备来进行检测。

高效液相检测n-亚硝基化合物，它除了具有气相色谱的高效、灵敏、选择性强等优点外，它还可以测定非挥发性亚硝胺。高效液相测定n-亚硝基化合物时要把这类物通过化学反应或光学反应分解成胺类物质和亚硝根离子，然后选择不同的衍生化试剂进行衍生，再由不同的检测器进行测定，这类物质的分解有柱前分解也有柱后分解，不同的分解时间采取 不同的衍生化时间。

4. 研究方案

仪器信息

仪器信息

试剂信息

试剂信息

色谱条件

色谱柱： ACE Excel 3 C18-AR 4.6mm100mm，3μm；

流动相： A为0.1%甲酸水；B为甲醇。

柱温：40℃；

进样量：20μl；

流速：每分钟0.5ml；

运行时间：13min；

梯度洗脱程序：

1.4 质谱条件

离子源：APCI（ ）；

检测方式：多反应监测（MRM）方式；

离子源温度：350℃；

Collision Gas: Medium

Curtain Gas：35 psi；

Nebulizer Current: 3.0 mA

Ion Source Gas1：35 psi；

4.1 供试品溶液的配制

取样品250mg，精密称定，于5ml量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

4.2 对照品溶液的配制

稀释剂（20%甲醇溶液）：取100ml甲醇，加入400ml纯水，混匀，即得。

对照品储备液1：精密称取15mg N-亚硝基二甲胺对照品至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。作为对照品储备液1（1.5mg/ml）。

对照品储备液2：精密称取15mg N-亚硝基二乙胺对照品至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。作为对照品储备液2（1.5mg/ml）。

对照品储备液3：精密移取100μl对照品储备液1、100μl对照品储备液2至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。作为对照品储备液3（15μg/ml）。

对照品储备液4：精密移取100μl对照品储备液3至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。作为对照品储备液4（150ng/ml）。

对照品溶液（系统适用性溶液）：精密移取50μl对照品储备液4至5ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。作为对照品溶液（1.5ng/ml）。

4.3 加标供试品溶液的配制

取样品250mg，精密称定，于5ml量瓶中，精密移取50μl对照品储备液4至同一量瓶中，加稀释剂超声溶解并稀释至刻度，作为加标供试品溶液。

4.4 外标法计算公式

其中：

m_对照品——对照品称样量，mg；

a_对照品——对照品的纯度，%；

V_对照品、V_供试品——分别为对照品、供试品稀释倍数；

A_对照品、A_供试品分别为各对照品峰面积、供试品溶液中各杂质峰面积。

5. 工作计划

个人方面：

（1）加强沟通。加强与带教老师的沟通，避免遗漏样品。

（2）加强自身学习，提高自身素质。积累工作经验，改进工作方法，向公司前辈多加学习，注重别人优点，学习他们处理问题的方法，查找不足，提高自己。