鉴定蜂蜜蛋白质掺假检测方法的研究毕业论文

论文总字数：18011字

摘 要

本文首次提出利用高效液相色谱法鉴别蜂蜜中掺入的蜂王浆来源的蛋白质。通过建立蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸的液相色谱检测方法，基于161个各产区的纯正蜂蜜数据，提出了纯正蜂蜜的应满足的要求：蜂蜜中10-羟基-2-癸烯酸含量应小于0.5mg/kg。在五种常见蜜种的蜂蜜中添加多水平的某一个蜂王浆，回收率数据表明本方法适用性较好。采用本文建立的检测方法，对120个日常检测样品进行鉴定，其中16个有10-HAD检出，判断被认为掺有蜂王浆来源的蛋白质。本方法填补了蜂蜜中掺入蛋白质的检测领域的空白，大大提升了掺假检测能力。

关键词：蜂蜜掺假；蛋白质；液相色谱

Identification of detection methodsfor protein adulteration in honey

Abstract

A method based on HPLC was proposed to identify the adulteration of royal jelly protein in honeyfor the first time.By establishing a liquid phase method for the determination of 10-hydroxy-2-decenoic acid in honey, based on the data for 161 pure honey from different production area, the requirement for pure honey was put forward: the content of 10-hydroxy-2-decenoic acid in honey should be less than 0.5 mg/kg. The method was proved to be suitable by the gradient addition of a certain royal jelly to 5 typical kindsof honey.The detection method established in this paper was applied to identify 120 samples offered by bee farmers and honey suppliers. 10-HDA was detected in 16 samples which indicated that these honey were adulterated with protein from royal jelly.This method fills in the blank of the detection field of adulterated protein in honey and greatly improves the detection ability of adulterated protein.

Key words：Adulteration of honey，Protein，Liquid chromatography

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1关于蜂蜜 1

1.2研究现状 1

1.3掺假现状 1

1.4蜂蜜掺假检测方法 2

1.5蜂蜜蛋白质掺假检测方法 2

1.5.1氨基酸含量比率分析检测法 2

1.5.2 SDS-PAGE分析检测法 3

1.5.3淀粉酶活性检定法 3

1.5.4免疫印迹分析检测法 3

1.6本次研究的主要研究内容 4

1.6.1研究意义 4

1.6.2研究内容 4

第二章 实验部分 5

2.1 仪器与试剂 5

2.1.1仪器 5

2.1.2试剂 5

2.2蜂蜜材料 5

2.2.1纯正蜂蜜 5

2.2.2验证蜂蜜 5

2.3实验条件 6

2.3.1溶剂配置 6

2.3.2蜂蜜样品前处理 6

2.3.3 高效液相色谱条件 6

第三章 结果与讨论 7

3.1 前处理条件的优化 7

3.2 线性关系、检出限与定量下限 7

3.3方法学考察 10

3.4检测方法的应用 14

结论 17

致谢 18

参考文献 19

第一章 绪论

1.1关于蜂蜜

蜂蜜是一种天然的甜味品，同时也具有很高的营养价值，是现如今老少皆宜的一种高营养的保健食品。目前我国现有的蜂种资源主要以意大利蜂蜜与中华蜂蜜为主。蜂蜜的主要成分有葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖等，同时还含有多种微量成分，包括蛋白质、黄酮、酚类物质、糖苷类、氨基酸等^[1]，具有独特营养保健、伤口护理等功效^[2]。蜂蜜对于治疗呼吸系统疾病、心血管疾病、肝病、神经系统疾病也有着不可或缺的重要的作用，合理有效的食用蜂蜜对免疫系统的增强也有帮助。因此蜂蜜对于维护人体的健康也有着重要的作用

1.2研究现状

随着国民生活品质的提升以及人们对健康生活的日益重视, 消费者对这种天然保健品的需求量也呈现增长的趋势, 蜂蜜行业在经济市场中也呈现勃勃生机的发展态势，这种发展形势不仅仅存在于国内的生活需求，还与对外的进出口贸易息息相关，因此，蜂蜜的健康生产对推动经济的发展、维护进出口贸易版图也发挥着重要的作用。相应的，一些不法商家钻蜂蜜掺假检测技术不够健全完善的漏洞，看准这一时机谋求更多的利益，对蜂蜜进行掺假。具体的蜂蜜掺假手段有在纯正蜂蜜中加入水、淀粉、蔗糖等冒充镇蜂蜜，或者在纯正蜂蜜中掺入果葡糖浆、大米糖浆等，蜂蜜的掺假方法不胜枚举。虽然食用掺假蜂蜜对人体不会产生不良影响，但是这种不正当的掺假行为不仅欺骗了消费者、影响了国内外蜂产品市场的健康稳步发展,给辛苦养殖蜂蜜的蜂农的生活也会带来严重负面影响,甚至会给蜂产品行业带来不正风气，同时也影响了我国蜂产品在国际上的声誉。因此, 寻找真正简便、快捷、易操作并且针对性强的蜂蜜掺假鉴别方法变得日益迫切。

1.3掺假现状

目前主要的掺假手段是向蜂蜜中添加糖类及其产物，譬如大米糖浆、木薯糖浆、甜菜糖浆等^[3]。GB/T 18932.1-2002通过稳定碳同位素比值质谱法鉴别蜂蜜中碳-4植物糖的含量，该鉴别方法需要测定蜂蜜中蛋白质的稳定碳同位素比值^[4]，纯正的蜂蜜含有约0.1 %的蛋白质，在日常检测工作中有些蜂蜜样品无法提取出蛋白质，Hao Dong等提出无法提取出蛋白质的蜂蜜被认为有掺假嫌疑^[5-6]。

蜂蜜中蛋白质作为蜂蜜中不可或缺的一部分，由于糖浆不含蛋白质，因此不法商们在向蜂蜜中掺入糖浆的同时会添加外源性蛋白质，并调节蛋白质的碳同位素比值在合理范围内，（加合适同位素外源性蛋白）满足碳-4植物糖测定要求，从而满足GB/T 18932.1-2002的检测要求来蒙混检测。目前，外源蛋白质的添加方式主要是通过在掺入糖浆的同时掺入适量奶粉，针对这类掺假手段，可以通过外源性酪蛋白的检测来鉴别。目前市场上出现了另一类掺假蜂蜜，这些蜂蜜满足GB/T 18932.1-2002中稳定碳同位素比值的要求，但是通过其他的光谱学方法等则明显显示其中混有糖浆类物质。

各检测结果之间的矛盾说明造假手段已经升级，不法商人通过添加非奶粉类的外源蛋白质逃避现有的检测手段，从而使得掺假蜂蜜不易被检出，因此寻找有效的蜂蜜掺假检测方法变得日益紧急。

1.4蜂蜜掺假检测方法

针对现存在的蜂蜜掺假行为，现有蜂蜜掺假鉴别方法主要有核磁共振法、糖指纹图谱法、液相色谱-同位素质谱法、理化指标分析法（水分，密度，粘度和流变性懂的测定，色泽，淀粉酶的测定，金属元素、酸度和电导率的测定，羟甲基糠醛的测定等）、气相色谱-质谱分析法等^[7-11],都是从蜂蜜中糖及其产物的方向研究。核磁共振法的检测掺假的准确度较高，但是该法的应用具有局限性它受限于数据库的内容量，蜂蜜复杂的组分以及多样的影响因素都会对该法的应用产生影响，同时该法的设备成本较高也不利于该法的大规模推广使用。理化指标分析通过对蜂蜜各个理化参数的测定，对蜂蜜的掺假情况作出初步判断，但是随着掺假手段不断地升级，将蜂蜜中的理化参数调配至合理也变得简易，因此该法的检测已经不能满足现如今高端蜂蜜掺假检测的需要了。液相色谱-同位素质谱法通过IRMS在线测定蜂蜜中各个糖组分的δ¹³C值，并且对C3植物糖的掺假进行鉴定。气相色谱-质谱分析法的实验步骤十分繁琐，不适合实验室大规模大范围投入使用。这几种方法都是针对蜂蜜中糖类组分的构成分析来判定蜂蜜是否存在着掺假，对于掺假检测技术的研究有补充意义。

1.5蜂蜜蛋白质掺假检测方法

检测蜂蜜是否存在着掺假行为并不能局限于片面的单个组分的分析研究。为了更好的完善蜂蜜掺假的检测技术，还可以分析蜂蜜中蛋白质的组分。现已存在的蛋白质鉴别检测技术有氨基酸含量比率分析检测法、SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳）分析检测法、淀粉酶活性检定法、免疫印迹分析检测法等^[12]。对蜂蜜中蛋白质组分的检测分析可以有效地鉴定出蜂蜜真伪，并且为蜂蜜掺假的鉴定方法提供了一个新的方向，这些从蜂蜜蛋白质角度入手的掺假检测方法不仅可以丰富蜂蜜的掺假检测方法，而且该多种蛋白质掺假鉴定方法对于检测灵敏度的提升都具有重要的意义。

1.5.1氨基酸含量比率分析检测法

氨基酸是构成蜂蜜蛋白质的基础物质，蜂蜜中的氨基酸种类非常多，氨基酸的种类多少也与蜂蜜的复杂程度息息相关，因此，不同种类的蜂蜜其氨基酸含量也存在着多种差异。通常蜂蜜中含有脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸等20余种氨基酸。蜂蜜中氨基酸的含量比例并不是固定的，它会因蜂蜜来源的相异之处而出现不同的结果，因此可以通过蜂蜜中不同种类的氨基酸因地域差异而产生的这些不同判定蜂蜜的本源以及鉴别蜂蜜。但是，蜂蜜中氨基酸的构成复杂并且容易受到各种因素的影响，比如来源地的气候条件、土壤因素的相异之处从而导致不同的结果反映，得到不同的信息。因此仅仅依据氨基酸含量的比率的差异来判定蜂蜜是否存在着蛋白质掺假还存在着一定的困难。

1.5.2 SDS-PAGE分析检测法

该法主要是通过分析蜂蜜中蛋白电泳行为来判定蜂蜜是否掺假，主要是在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中添加离子去污剂以及强还原剂，从而可将蛋白质电荷的影响忽略不计。不同蜂蜜的蛋白电泳图谱因受到蛋白质分子量的不同而产生差异，因此可以通过蛋白质电泳图谱判断蜂蜜是否具有蛋白质掺假。但是这种方法存在着精密度不高的问题，仅能通过这种方法大致的观察了解到蜂蜜蛋白之间的差异，并不能用于实验研究这种高精准度以及大规模数据容量的需求。

1.5.3淀粉酶活性检定法

酶在蜂蜜的构成中也占有很大的比重，蜂蜜中含有许多种酶，如还原酶、淀粉酶、蔗糖酶等。大部分酶的化学本质就是蛋白质，蜂蜜中的淀粉酶是一种动物源淀粉酶，其稳定性较差，活性容易受到贮存温度以及时间的影响，而假蜂蜜中的淀粉酶则是一种来自细菌的诺维信耐高温淀粉酶，该种酶由人为添加并且具有耐高温、高活力的特点。因此可以通过检测蜂蜜中淀粉酶的活性差异来鉴别蜂蜜的真伪，可以通过设置不同的温度以及观察不同的时间来确定蜂蜜中酶的成分来源，合理设置进行多节点多时间段多个温度检测来确定酶的活性，做多组平行实验减少误差，获得较为精准的数据结果。然而，该种检测方法耗时长短不同，若超出一定期限就会降低该种方法的检测意义。

1.5.4免疫印迹分析检测法

该法是通过利用不同来源的蜂蜜的蛋白之间的免疫特异性，将蛋白质转移到膜上，并利用抗体进行检测的一种复合型蛋白质掺假检测方法，该法的可分析数据庞大、敏感度高，是最近几年来被研究利用的用于鉴别蜂蜜真伪的有效方法之一，特定的蜂蜜蛋白只能与它相应的抗体反应，而掺有其他蜂蜜的混合蜂蜜的蛋白质不仅可以与它自身蛋白质的抗体反应，而且可以与其他蜂蜜蛋白的抗体发生反应，通过比较不同蜂蜜蛋白提取物与相应抗体反应的结果，可以鉴别出掺假蜂蜜。因此，通过分析蜂蜜中蛋白质的免疫学特性差异可以检测蜂蜜是否掺假。同时，由于抗原和抗体之间的反应的高敏感性和高特异性，即使掺假的蜂蜜中含有极少的其他蜂蜜蛋白，免疫印迹分析法也可以区分它们，这种方法使蜂蜜真伪鉴别结果的准确度进一步提高，免疫印迹分析检测法主要是基于蜂蜜蛋白质的稳定性和特异性来鉴别蜂蜜是否存在着蛋白质掺假。但该种检测方法实验耗时过长并且操作繁琐复杂，不能满足大数据大容量的检测需求。

1.6本次研究的主要研究内容

1.6.1研究意义

目前尚无检测蜂蜜中10-HDA 含量的文献报道，本文首次提出通过测定蜂蜜中的10-HAD含量来鉴别蜂蜜是否存在蛋白质掺假，通过检测蜂蜜中10- 羟基-2- 癸烯酸的含量来进行蛋白质掺假判定，对提高蜂蜜蛋白质掺假检测方法的灵敏度，丰富蜂蜜蛋白质掺假检测手段也有重要意义，对于打击不法掺假手段，维护正常合理健康的蜂蜜市场，保证蜂蜜的质量，保证消费者正常消费权益都有重要的作用。实验结果的可研究性以及可参考性有了保证，该方法直观简易易操作且灵敏度高，满足了现今的掺假检测要求。

1.6.2研究内容

Lee Suan Chua等利用质谱发现蜂蜜的蛋白质中包含了主要蜂皇浆蛋白质(MRJP)^[13-14] ，高端掺假掺入的同源性蛋白蜂王浆(碳13=-23‰左右)，既简单又难以鉴别，现有的掺假检测方法无法准确的检测出蜂蜜中掺入的外源性蛋白，既有的掺假检测方法也具有局限性。10- 羟基-2- 癸烯酸（10-Hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）是蜂王浆中所含有的特殊的高效生物活性物质，而采蜜的外勤蜂上颚腺中的10-HDA 含量则极低^[15]，也即纯正蜂蜜中10-HAD含量极低，存在阈值。因此本实验主要通过大量的蜂蜜10-HAD的含量的测定建立阈值来判定蜂蜜是否存在着蜂王浆掺假。

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