酪蛋白超高压产物的抗原水平分析及生物利用度评价毕业论文

论文总字数：11928字

摘 要

以牛乳作为原料生产的婴儿配方乳制品是母乳较为主要的替代品，其中含有的酪蛋白营养价值较高且含有许多对人体有益的生物肽类物质。因此，牛乳中所含酪蛋白的消化吸收的程度就会显得尤为重要。本研究主要通过超高压技术对酪蛋白进行处理，获得降低酪蛋白抗原性的最佳处理条件的组合。通过所建立的Caco-2 细胞模型，来对处理后的酪蛋白肽进行生物利用度的评价，探讨超高压技术对奶制品消化产物的吸收及影响。研究得到通过超高压处理乳源酪蛋白时，即压力350 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min、高压次数1次的条件下，超高压技术结合婴儿胃肠消化条件对于乳源酪蛋白抗原水平的消减起到一定的作用。在模拟婴儿胃肠道条件下，抗原消减最优组的酪蛋白肽转运吸收率明显高于对照组（P＜0.05）,此条件下超高压处理技术能使酪蛋白在婴儿胃肠道中的消化性、致敏性均能得到改善。

关键词：酪蛋白，超高压处理，生物利用度

Antigen level analysis and bioavailability evaluation on ultra-high pressure processed casein products

Abstract：Milk as a raw material for the production of infant formula dairy products are more important alternatives to breast milk, which contains the higher nutritional value of casein and contains many beneficial bio-peptide substances. Thus, the degree of digestion and absorption of casein contained in milk will be very important. In this study, casein was treated mainly by ultrahigh pressure technique to obtain a combination of the best treatment conditions to reduce the antigenicity of casein. The Caco-2 cell model was used to evaluate the bioavailability of treated casein peptides, and the absorption and effects of ultra-high pressure on dairy products were discussed. After the treatment of milk casein by ultra high pressure, the pressure of 350 MPa, temperature 30 ℃, holding time 20 min, high pressure times 1 times, the ultra-high pressure technique combined with infant gastrointestinal digestion conditions for milk casein reduction antigen levels play an important role. In the simulated infant gastrointestinal condition, the uptake rate of casein peptides was significantly higher than that of the control group (P lt;0.05). Under this condition, the digestibility and sensitization of casein in the infant gastrointestinal tract can be adjusted by ultra-high pressure treatment technology.

KEY WORDS: Casein, Ultra high pressure treatment, Bioavailability

现今市场以牛乳作为原料生产的婴儿配方乳制品是母乳的重要补充品及替代品。牛乳含有丰富的营养物质，同时含有含量丰富的酪蛋白 ^[1]。酪蛋白中不仅含有丰富的人体所需的必需氨基酸，同时其消化产物具有能调节机体功能的生物肽。但是牛乳特有的α_s-酪蛋白是造成乳制品相对于母乳难消化的一点主要原因，由于多数的牛奶蛋白都有潜在的致敏性，因此牛乳也极易引起食物过敏。超高压技术是一种非热加工食品技术，处理工艺易于实施且能较好的保留食品的天然风味与营养的一种处理方法^[2]。超高压技术通过改变过敏原蛋白的高级结构导致过敏原蛋白的抗原表位发生变化，从而能够很好的降低食品的致敏性，并能够有效的提高其消化产物中的各类调节机体功能的生物肽吸收程度。基于以上研究思路和背景，本研究主要通过超高压技术对酪蛋白进行处理，获得降低酪蛋白抗原性的最佳处理条件的组合。通过所建立的Caco-2 细胞模型，来对处理后的酪蛋白肽进行生物利用度的评价，探讨超高压技术对婴儿配方奶制品消化产物的吸收及影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

如表1所示。

表1 主要试剂

试剂名称	生产商
酪蛋白	美国Sigma公司
胃蛋白酶	南京生兴生物技术有限公司
胰蛋白酶	南京生兴生物技术有限公司
兔抗酪蛋白单克隆抗体	英国Abcam公司
辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG	英国Abcam公司
脱脂奶粉	美国Becton Dickinson公司
吐温-20	美国Amresco公司
TMB显色液（ELISA HRP显色专用）	碧云天生物公司
三羟甲基氨基甲烷	上海阿拉丁生化科技股份有限公司
浓盐酸	上海凌峰化学试剂有限公司
磷酸二氢钠	上海凌峰化学试剂有限公司
磷酸氢二钠	上海凌峰化学试剂有限公司
L-亮氨酸	上海阿拉丁生化科技股份有限公司
PBS粉末	博士德生物工程有限公司
DMEM高糖培养基	江苏凯基生物技术股份有限公司
0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液	美国Gibco公司

表1 主要试剂（续）

试剂名称	生产商
胎牛血清	美国Clarkbio公司
四甲基偶氮噻唑蓝MTT	美国Sigma公司
二甲基亚砜DMSO	美国Sigma公司
PBS粉末	博士德生物工程有限公司
HBSS粉末	南京森贝伽生物科技有限公司
AKP测定试剂盒	南京建成生物工程研究所
荧光素钠	上海阿拉丁生化科技股份有限公司
谷氨酰胺	美国Sigma公司
非必须氨基酸	美国Sigma公司

1.2 主要仪器与设备

如表2所示。

表2 主要仪器

仪器名称	型号	生产商
倒置相差显微镜	IX51	日本Olympus公司
高速冷冻离心机	5417R	德国Eppendorf公司
二氧化碳培养箱	CCL-170B-B	新加坡艺思高科技有限公司
电子天平	XA105	美国METTLER TOLEDO公司
双人双面垂直洁净工作台	SW-CJ-2FD	上海博迅有限公司医疗设备厂
立式压力蒸汽灭菌器	YXQ-LS-30SII	上海博迅有限公司医疗设备厂
酶标分析仪	RT-6000	美国Rayto公司
微量振荡器	WZ-2A	北京海淀电子医疗仪器厂
电热鼓风干燥箱	XTMD-8222	上海精宏实验设备有限公司
电热恒温水浴锅	DK-S22	上海精宏实验设备有限公司
微型漩涡混合仪	WH-3	上海沪西分析仪器厂
无菌采样袋	12cm*18cm	青岛高科技工业园海博生物技术有限公司
pH计	PHS-25	上海精密科学仪器有限公司
台式低速离心机	L550	湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
手压式封口机	SF-200	宁波斯普利电子有限公司
Millicell-ER跨膜电阻仪	MERS00002	美国Millipore公司
智能生化培养箱上海	SHP-350	精宏实验设备有限公司

1.3 研究内容

1.3.1 超高压处理测定乳源酪蛋白抗原性

配备酪蛋白溶液，以压力、温度、保压时间、高压循环次数四个处理因素进行超高压试验，并对处理后的酪蛋白进行体外模拟成人胃肠消化，酪蛋白抗原消减抑制率为指标进行单因素试验和正交设计来对超高压处理后酪蛋白消化水平条件进行优化，获得最佳的压力、温度、保压时间、高压循环次数组合，采用间接酶联免疫法测定乳源酪蛋白抗原性。

1.3.2 成功建立Caco-2单层膜模型

建立Caco-2细胞单层模型，对模型进行跨膜电阻值的测定、荧光素钠标志物的吸收转运，对本研究所建立的细胞模型进行综合评价，最终实验得到了有效可用的酪蛋白肽吸收模型。

1.3.3 测定Caco-2细胞的吸收率评价其生物利用度

乳源酪蛋白经过超高压处理及其模拟胃肠消化后，通过测定酪蛋白肽在Caco-2细胞单层模型中肽氮的吸收率，来评价其生物利用度情况。

1.4 研究方法

1.4.1 超高压处理酪蛋白

用电子天平称取100mg酪蛋白加入10 mL PH8.0的Tris-HCl缓冲液混合均匀，密封于无菌采样袋中，将其放入超高压设备中，并完全浸没于传压介质中，高压后的样品立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 超高压处理对乳源酪蛋白过敏原消解条件的优化

1.4.2.1 不同的压力处理乳源酪蛋白

施压温度为25 ℃，保压时间为20 min，高压次数1次，分别选取100、200、300、400 MPa的压力条件处理乳源酪蛋白。

• • • 1. 不同的施压温度处理乳源酪蛋白

处理压力为200 MPa，保压时间为20 min，高压次数1次，分别选取15、25、35、45 ℃的温度条件来处理乳源酪蛋白。

1.4.2.3 不同的保压时间处理乳源酪蛋白

处理压力为200 MPa，施压温度是25 ℃，高压次数1次，分别选取10、20、30、40 min的保压时间处理乳源酪蛋白。

• • • 1. 不同的高压次数处理乳源酪蛋白

处理压力为200 MPa，施压温度是25 ℃，保压时间是20 min，分别选取1、2、3次的高压次数来处理乳源酪蛋白。

• • • 1. 超高压处理乳源酪蛋白的条件优化 选取处理压力、施压温度、保压时间和高压次数作为实验因素，正交实验设计见表3。

表3 超高压消减乳源酪蛋白过敏原正交实验因素水平表

水平	压力(A)/MPa	温度(B)/℃	保压时间(C)/min	高压次数(D)/次
1	250	20	15	1
2	300	25	20	2
3	350	30	25	3

• • 1. 模拟婴儿胃肠消化实验

将超高压处理后的乳源酪蛋白，用0.2 mol/L HCL调节pH至3.0，在37 ℃恒温水浴锅中预热，加入胃蛋白酶4 mg，恒温消化2 h；然后用0.2 mol/L NaOH调节样液pH至7.0，添加4 mg胰蛋白酶，放入37 ℃恒温水浴锅中，恒温消化4 h。最后100 ℃沸水浴灭活10 min，4000rpm离心10 min，放入 -4℃冰箱保存。

1.4.4 乳源酪蛋白水解物抗原性的测定

间接竞争Elisa法：将未处理抗原包被96孔酶标板，设置空白对照组，放入冰箱4 ℃过夜；用5 g/100mL封闭液37 ℃封闭2 h，PBST洗板后加入1:5000稀释的单克隆抗体和稀释50倍的待测抗原，37 ℃竞争反应2 h；再次洗板后加入1:100000 HRP标记的二抗，37 ℃竞争反应1 h；洗板后加入TMB显色液显色，用酶标仪测定波长370 nm处的吸光度。

抗原水平抑制率计算公式：

抑制率=（1-B/B₀）×100%=(OD_空白对照－OD_待测样品)/OD_空白对照×100%

式中：B₀为空白对照组的吸光度；B为待测样品的吸光度。

1.4.5 细胞培养

将Caco-2细胞培养于25cm²细胞培养瓶中，加入3mL完全培养液，放置于5%CO₂、37℃的二氧化碳培养箱中，每隔一天换一次完全培养液，每4～7天按照1:2传代一次。

1.4.6 Caco-2细胞单层模型的鉴定

1.4.6.1 Caco-2细胞单层膜完整性的验证

通过测定Caco-2细胞模型的跨膜电阻来评价细胞单层的完整性。Transwell板中细胞培养21天，用HBSS缓冲溶液清洗3遍，在肠腔侧（AP）和基底侧（BL）侧加入HBSS溶液，用跨膜电阻仪测定每个孔的电阻值。计算公式：

TEER=（R₁-R₀）×A

式中：R₁是Caco-2细胞孔的电阻值；R₀是空白孔的电阻值；A为Transwell板小室的膜面积（cm²）。

1.4.6.2 Caco-2细胞单层通透性的验证

从培养箱中取出Caco-2细胞，吸弃培养液，用预热37℃的HBSS溶液冲洗3次。在Transwell板中的AP侧加入0.5mL的HBSS，BL侧加入1.5mL的HBSS溶液，将Transwell培养板放入二氧化碳培养箱中平衡30min。用HBSS溶液配制浓度为330µg/mL的荧光素钠溶液，吸弃AP侧的HBSS溶液，加入0.5mL的330µg/mL的荧光素钠溶液于AP侧，然后放入二氧化碳培养箱中孵育3h，取BL侧的溶液200µL于96孔板中，设置5个平行孔，用HBSS溶液配制浓度为0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.5µg/mL、5.0µg/mL、10.0µg/mL的荧光素钠标准溶液，用酶标仪在490nm处测吸光度。根据标准曲线计算转运的荧光素钠溶液的浓度。根据公式计算其吸收转运的表观渗透系数（P_app），计算公式如下：

P_app =ΔQ/（Δt*A*C₀）

式中:ΔQ（mg）是Δt（s）时间内的转运量，A（cm²）是Transwell培养板中小室的膜表面积，C₀（mg/mL）是AP侧荧光素钠溶液的初始浓度。

1.4.7 酪蛋白肽氮含量的测定

1.4.7.1 总氮含量的测定

用电子天平准确称量4.0mg的待测样品于具塞玻璃试管中，加入6M盐酸2mL，塞紧玻璃盖密封后放入110℃烘箱中进行24h水解。水解结束后，继续放在烘箱中，待液体全部蒸发后，然后用300μL的蒸馏水复溶，依次向96孔板加入80μL的磷酸缓冲液、10μL样品和不同浓度的L-亮氨酸标准溶液（0、2、4、6、8、10、12、14mmol/L），80μL0.1%的三硝基苯磺酸（TNBS），然后将其避光放到50℃恒温水浴锅中放置1h，每孔加入16μL 1mol/L的HCl终止反应，于405nm处测定其吸光值。

1.4.7.2 氨基氮含量的测定

用3.5%的磺基水杨酸溶解待测样品，6000转离心10min，采用与上述一样的方法（同1.4.7.1）在405nm处读取待测样品的吸光度。样品中肽氮含量的计算公式为：

肽氮含量（PN）=总氮含量-游离氨基氮含量

1.4.8 酪蛋白肽的生物利用度评价

1.4.8.1Caco-2细胞吸收转运实验

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