豌豆ALOG基因家族成员SYL7的克隆和功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题的意义

alog（arabidopsis lsh1andoryza g1）基因家族来自拟南芥和水稻中两个具有代表性的转录因子lsh1和g1。已有的研究表明，该基因家族在陆生高等植物中存在多个拷贝，编码具有转录因子活性的蛋白，参与植物胚胎发育、器官形成、开花、果实成熟等生物学过程。目前，在豆科植物豌豆中，alog基因家族成员的功能尚不清楚。本课题拟构建豌豆alog基因家族成员的系统发育树，通过挖掘已有数据信息，探明syl7基因的组织表达模式，并通过病毒介导的基因沉默技术研究该基因功能。对syl7的研究有助于揭示豌豆alog基因家族的功能。

二、国内外研究进展

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标：

构建豌豆alog基因家族系统发育树、研究alog家族基因表达模式及syl7基因功能

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

一、植物材料的种植

豌豆种子在水中浸泡24 h后，播种于土下1 cm处，放置于光照充足、温度适宜的室内生长。

二、生物分析软件

序列对比：MEGA-X、NCBI

进化分析：MEGA-X、https://itol.embl.de/

引物设计：NCBI Primer

三、引物设计

Sense Primer 5'-CG-GAATTC-GACCACCACTTTCTGCTT-3' EcoR IAnti-Sense Primer 5'-CG-GGATCC-CGACAATGTTGCGATTAG-3' BamH I

四、CTAB法提取植物基因组DNA

1、将CTAB缓冲液置于65℃水浴中预热；

2、取0.5 g植物样本于研钵中，分批次倒入液氮，研磨充分；

3、将研磨后的粉末倒入10 mL的离心管中，加入3.5 mL提取液，缓慢颠倒几次，使之混匀；

4、样品于65℃水浴40-60 min，水浴期间每隔20 min缓慢颠倒混匀一次；

5、水浴后加入3.5 mL氯仿-异戊醇（24:1）（在通风橱中操作）轻轻混匀，离心（10,000 rpm 5 min）；

6、取离心后上清液于新的离心管中，加入5.6 mL冷异丙醇，于-20℃放置30 min；

7、将析出的DNA离心（4℃ 10,000 rpm 10 min），弃上清液，用2 mL 70%乙醇漂洗两次，离心（4℃ 10,000 rpm 5 min），干燥，溶于2 mL 1/10 TE溶液中，保存于4℃冰箱中。

五、DNA聚合酶式反应（PCR）

反应条件：1）94℃变性3 min；2）94℃变性30 s；3）引物温度30 s；4）72℃延伸5 min；进行35循环扩增，最后72℃延伸反应10 min。

取5uL产物电泳，鉴定扩增结果。

六、VIGS实验

1、热击法转化农杆菌GV3101

1）将农杆菌GV3101感受态细胞置于冰上融解后，加入1-2 μg质粒轻轻混匀后于冰上放置45 min；

2）放入液氮中速冻1 min，37℃水浴3 min；

3）加入600 μL液体LB在28℃摇瓶3 h；

4）取30 uL涂平板（含25 μg/ml利福平， 100 μg/mL庆大霉素， 50 μg/mL卡那霉素）， 28℃倒置培养2 d；

2、VIGS接种豌豆的方法

1）挑单克隆接种到20 mL液体LB培养基（含25 ug/mL利福平，100 μg/mL庆大霉素，50 μg/mL卡那霉素）中，28℃摇床培养至OD₅₅₀达到1.2-1.5；

2）室温离心（3500 rpm 5 min）用20 ml渗透培养基(10 mM NaCI, 1.75 mM CaCl₂,100 μM acetosyringone)重悬菌体，室温静止90 min；

3）将菌液用1 mL注射器渗透到刚发芽的豌豆最幼嫩叶片。

3、观察

在接种后14天后开始观察，直至整个生活周期结束。

4. 研究创新点

目前，在豆科植物豌豆中，ALOG基因家族成员的功能尚不清楚。本研究拟构建豌豆ALOG基因家族系统发育树、研究ALOG家族基因表达模式及SYL7基因功能，研究结果将为系统研究豌豆ALOG家族基因功能奠定基础。

5. 研究计划与进展

1、研究周期

2020年2月——2020年5月

2、研究阶段