葡萄雄性不育基因的克隆和表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.项目的研究意义：

雄性不育（male sterility）是植物界存在的普遍现象，是指在有性繁殖过程中雄蕊不能正常生长和产生有效花粉，而雌蕊能正常发育和受精。在杂交育种中以雄性不育系为材料控制授粉，可以获得高产杂交品种^[1]。雌能花品种在果树育种和生产中起到了重要的作用，是杂种优势利用的重要工具。雌能花品种作为育性基因的突变体，也是研究雄蕊及花粉发育过程，育性基因表达、功能、调控网络以及雌雄异株植物的起源与进化的珍贵材料。在生产上，特别是葡萄上，雌能花是培育优质无核葡萄的优良品种。同时雄蕊败育，可降低树体的养分消耗。葡萄花朵小，去雄不易，利用雌能花品种作母本进行杂交时，可省去人工去雄的过程，简化育种程序，提高杂交效率。因此在果树生产和育种中具有十分重要的应用价值。

‘魏可’葡萄( wink) 属欧洲种^[2]，是一种优质、极晚熟葡萄品种，具有很大的市场潜力。1987 年日本山梨县志村富男通过 kubel muscat 与甲斐路杂交选育而来。果实紫黑色，果穗圆锥形，果穗较大，果粒卵圆形，可溶性固形物含量高达20左右，味甜，汁多，无香气。树势强，表现丰产，抗病力较强。是雄性可育品种。

2. 研究的基本内容和问题

1.项目的研究目标、内容和拟解决的关键问题

1.1 项目研究目标

为了进一步从分子水平阐述雄性不育相关基因vvippr在葡萄雄性不育机制中的作用机理，本研究以‘魏可’和‘钟山红’葡萄不同时期花穗为材料，克隆了vvippr基因，分析了此基因碱基序列特征，并对该基因进行生物信息学分析。

3. 研究的方法与方案

2.1技术路线

2.2实验方案

（1）材料的获取

分别采集4月10日、4月13日、4月15日、4月17日、4月19日、4月22日、4月24日、4月25日、4月27日、4月29日、5月6日的两个品种葡萄花穗样品，从 3 次生物学重复的植株上随机采集，取样时兼顾阴阳两面，用液氮速冻，带回实验室，保存于－80 ℃冰箱中待用。

（2）雄性不育相关基因VviPPR的克隆

采用多糖多酚植物组织总RNA 提取试剂盒( 成都福际公司产品) 提取上述各时期样品的总RNA，利用反转录试剂盒 PrimeScriptTM 1st Str cDNA Synthe-sis Kit ( TaKaRa公司产品)反转录合成cDNA第一条链，稀释后的cDNA用于实时荧光定量PCR。以cDNA为模版，进行PCR扩增，反应体系(25.0μl)为稀释后的cDNA1.0μl，5×PrimeSTAR GXL buffer 5.0μl，dNTPmixture 2.0μl，PrimeSTAR GXL DNA polymcrace 0.5μl，上、下游引物各0.5μl，灭菌后ddH2O15.5μl;反应程序98℃预变性5min;98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸80s，35个循环;68℃延伸10min，4℃保存。

（3）生物信息学分析

使用BCBI上进行blast分析，对VviPPR的氨基酸序列与其它物种的氨基酸序列进行同源性比对。

采用在线分析工具ExPASy-ProtParam（https//web.expasy.g/pro- -tparam/）分析葡萄VviPPR氨基酸序列的氨基酸数目、等电点、分子量、疏水性等等理化性质分析。

使用SignalP 4.1Serve（http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线软件对VviPPR蛋白进行信号肽预测。

利用TMHMM Severv. 2.0（http//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）在线软件分析VviPPR蛋白跨膜结构域。

使用NetPhos 3.1 Serve（http//www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在线工具对VviPPR蛋白序列潜在磷酸化位点预测分析。

通过ExPASy（http//web.expasy.g/prot-scale/）在线软件对VviPPR氨基酸亲疏水性进行分析。

使用SOPM（https//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?Pagenpsa_sopma.htmL

）在线软件分析VviPPR 蛋白二级结构。

利用PSORT II Prediction在线工具（http//pst.hgc.jp/fm2. html）对VviPPR蛋白进行亚细胞定位预测。

2.3可行性分析

申请人所在实验室果树基地有数量充足生长良好的‘魏可’与‘钟山红’品种葡萄，可以用于本试验。

本实验室已开展葡萄课题研究多年，拥有该研究中所需的各种仪器、药品等，采用的方法均为本实验室已有成熟方法，预期在一年时间内可以进一步从分子水平阐述雄性不育相关基因VviPPR在葡萄雄性不育机制中的作用机理。因此，本申请项目研究内容合理可行。

4. 研究创新点

葡萄的育性受多种因素影响，本研究项目将进一步从分子方向探索雄性不育相关基因的作用机理。获得的结果将为葡萄生产及葡萄果实的品质性状遗传改良提供理论依据、技术手段和基因资源，对发掘优质种质资源具有重要意义

5. 研究计划与进展

2019年3月-4月：材料准备阶段（生长状况良好的‘钟山红’葡萄、‘魏可’葡萄树及处理药品）；

2019年4月-7月：获取材料

2020年2月-3月：进行实验。得出实验中存在的问题，必要时重复进行某些步骤。