塑料降解酶pETase-MHETase融合蛋白的设计开题报告

课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献）

1. 课题的意义

塑料在全球经济中被广泛运用，每年至少有3.5亿吨至4亿吨的塑料被生产。全世界生产的PET只有不到50%被回收，仅有不到5%的PET被重新生产成塑料水瓶。大多数的回收塑料被送到垃圾处理厂填埋或焚烧，这种处理方法造成大量的能源浪费和环境污染。有研究发现，塑料还在海洋生态系统中造成严重不良影响。包括PET在内的大多数塑料都很难在自然环境下降解，造成严重的环境污染，其产生的塑料微粒（microplastics）尤其对哺乳动物的健康存在危害^[1]。

生物酶法以高效安全著称，并在食品、环境等领域得到广泛应用。近年来，采用酶法降解PET的研究发展迅速。2016年，日本的Shosuke Yoshida等人在垃圾处理站分离出一种新型细菌Ideonellasakaiensis 201-F6，它可以利用PET作为能量来源和碳源^[2]。研究分离鉴定得到PETase和MHETase两种酶分别负责两步降解PET塑料，能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸(MHET)和乙二醇(EG)。其中，PETase只能将PET塑料从高聚物状态降解到低聚物或寡聚物状态，进一步将其降解为对苯二甲酸和乙二醇单体还需要MHETase的催化。PET降解酶的发现，为生物降解合成塑料打开了一扇门。因此，针对PET降解酶的进一步改造，提高其降解效率，为今后PET降解酶的工业应用改善塑料污染提供理论依据。

2. 国内外研究进展

2016年日本科学家Shosuke Yoshida从大阪Sakai市的250个含有PET残骸的环境样品进行筛选时，发现了NO.46细菌联合体能够贴附于PET膜生长，进一步研究发现了Ideonella sakaiensis 201-F6（简称I. sakaiensis），观测其生长，发现了其对PET具有降解活性。随后，研究人员对这种NO.46细菌联合体进行了摇床培养和筛选，通过基因测序发现了其中一段与热烈镰刀菌（Thermobifida fusca）中的水解酶具有51%的氨基酸序列同源性的开放性阅读框，这种水解酶具有PET降解活性。这类蛋白酶通过在PET表面进行点蚀，将PET水解产物释放到水中去。自然界已有不少酶有这种水解活性，据报道的就有酯酶（esterases）、脂肪酶（lipases）和角质酶（cutinases）^[3]等，经过比较，发现这种水解酶对PET具有最好的降解偏好，故取名为PETase。Shosuke Yoshida研究发现这种PETase只在室温下对PET表现出高水解活性，其耐热性不理想，为了提高其热稳定性，Shirke等人研究发现，通过在真核宿主毕赤酵母中表达糖基化LCC，能够有效避免蛋白质在高温下的聚集^[4]。Furukawa^[5]等人通过阴离子表面活性剂来提高蛋白的热稳定性等方法。韩国科学家SON也对其热稳定性进行了改进^[6]。当温度接近到PET的玻璃化转变温度（Tg≈75°C）时，塑料的酶降解速率可以加快^[7]。

除了PETase之外，Shosuke Yoshida还鉴定出了另一种以PET水解产物MHET

为底物的酶，将MHET水解成对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG），这种酶只能以MHET为底物，故命名为MHETase。

Austin H P学者对催化降解机理中的催化三联体和PETase的结构进行了阐释^[8]，该酶采用典型的α-/β-水解酶折叠，核心由7个α-螺旋和9个β-链组成。拥有这种结构的酶包括蛋白酶、脂肪酶和酯酶，他们都含有亲核His（组氨酸）催化三元组，能对不同化学成分的底物进行高效催化。PETase的催化活性部位较宽，就其同源的角质酶而言，角质酶只有一个二硫键，而PETase具有两个二硫键。

日本科学家Shosuke Yoshida就PETase降解酶的催化机理做出了预测模型^[4]，韩国学者SON也对其催化降解机理进行了补充^[6]。PET降解开始时，细菌分泌的PETase会利用具有底物结合裂缝的平坦疏水表面与PET表面结合。PET的降解过程可分为两个步骤：刻痕生成步骤和末端消化步骤。具有TPA末端（^TPAPET）的PET消化，也通过末端TPA分别在亚位点I和亚位点II处定位末端TPA和三个MHET部分实现。这类结合能产生多种PET单体和二聚体，如2-HE（MHET）₂，（MHET）₂，MHET和BHET。胞外PETase水解PET后，PET水解产物通过外膜蛋白（如孔蛋白）运输到周质空间。根据信号肽序列预测，MHETase是一种外膜锚定的脂蛋白,能将MHET水解成TPA和EG。TPA通过与含有TPA结合蛋白的TPA转运体结合进入细胞质，再经原儿茶酸（PCA）整合到三羧酸（TCA）循坏中。EG通过乙醛酸代谢到TCA循坏中。

PET降解的两步酶反应充分说明了PETase和MHETase结合使用的必要性，能够减少中间产物的积累，加速PET催化降解为TPA和EG，最终形成无污染的二氧化碳和水。且有研究表明中间产物MHET可能抑制PETase的活性，所以通过PETase和MHETase的串联反应消除MHET的积累极为关键。

除了上述关于结构和机理模型的研究外，Fusako Kawai对PET水解酶的结构基础和动力学研究做出了总结^[9]，莱比锡大学学者任伟也发表了关于PETase应用于塑料废物回收利用的展望以及合成塑料的理化性质对生物因素降解的障碍^[10]，孙英浦也在《科学咨询》中表示，对于PETase的结构解析和定点突变改善热稳定性实验，已经表明了PETase在白色污染治理方面的应用具有重要价值^[11]。

国内已有对PET降解酶的相关基因改造工程菌^[12]和运用复合菌株对PET（聚对

苯二甲酸乙二酯）降解的专利^[13]。

虽然国内已有从基因方向改造PET降解酶的相关专利，但仍未有从蛋白融合方面利用PETase和MHETase的融合表达实现对底物的高效绿色转化的研究。

3. 应用前景

研究塑料降解酶的融合表达，对于开发高效的塑料降解酶体系具有重要的价值，能够改善我国塑料白色污染的困难局面。将塑料降解酶进行分子改造能实现从污染底物到绿色产物的有效生物降解途径，还可以应用塑料降解酶生物催化回收难降解塑料废弃物，包括海洋的塑料颗粒污染^[8]。

随着生产力与制造能力的提高，我国的合成塑料产量还会增多，快速且绿色的回收塑料新方法对于保持经济的可持续发展有十分重要的意义。

参考文献：

[1] PlasticsEurope. 2018. PlasticsEurope, plastics—thefacts 2018: an analysis of European plastics production, demand and wastedata. Plastics-Europe, Brussels, Belgium

[2] YoshidaS , Hiraga K , Takehana T , et al. A bacterium that degrades and assimilatespoly(ethylene terephthalate)[J]. Science, 351.

[3] Han,Xu, Liu, Weidong, Huang, Jian-Wen, etal. Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase[J].Nature Communications, 8(1):2106 Microbiology and Biotechnology, 2019.

[4]Stabilizing Leaf and Branch Compost Cutinase (LCC) with Glycosylation:Mechanism and Effect on PET Hydrolysis[J]. Biochemistry, 2018,57(7):1190-1200

[5] Furukawa M, Kawakami N, Oda K, et al.Acceleration of Enzymatic Degradation of Poly(ethylene terephthalate) bySurface Coating with Anionic Surfactants[J]. ChemSusChem, 2018

[6] Joo S, Cho I J, SeoH, et al. Structural insight intomolecular mechanism of poly(ethylene terephthalate) degradation[J]. NatureCommunications, 2018, 9(1):382

[7] Ronkvist sa M, Xie W, Lu W, et al.Cutinase-Catalyzed Hydrolysis of Poly(ethylene terephthalate)[J].Macromolecules, 2009, 42(14):5128-5138

[8] Austin H P, Allen M D, Donohoe B S, et al.Characterization and engineering of a plastic-degrading aromaticpolyesterase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2018:201718804.

[9] Kawai F , Kawabata T , Oda M . Current knowledgeon enzymatic PET degradation and its possible application to waste streammanagement and other fields[J]. Applied

[10] Wei R ,Zimmermann W . Microbial enzymes for the recycling of recalcitrantpetroleum-based plastics: how far are we?[J]. Microbial Biotechnology, 2017.

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1. 研究目的

寻找PETase与MHETase两功能蛋白结构域之间合适的连接肽，将PETase和MHETase进行蛋白质融合，并稳定高效表达，实现融合蛋白对PET的完全绿色降解。

2. 研究内容

依据现有对PETase和MHETase的蛋白质结构研究，设计PETase-MHETase融合蛋白的序列和结构域，构建融合蛋白表达载体，导入大肠杆菌中诱导表达。比较得到最适连接肽的序列结构。

3. 拟解决的关键问题

自2016年以来，对PET降解酶的研究日新月异，但目前仍未实现PET降解酶对PET的高效生物降解。PETase和MHETase的晶体结构研究已逐渐完善，其工作机理已基本明确。除各研究单位与生物科技公司各自对PETase基因工程菌的改造，目前未获得对PET具有高效生物降解的基因工程菌，尚未有PETase与MHETase融合表达的研究。因此在构建融合蛋白过程中，各结构域对蛋白成功融合表达所起的作用无处借鉴。不同连接肽对PETase和MHETase的融合表达的影响也需要进一步探索试验，需要通过大量的实验和对比筛选出灵活度高和具有疏水结构的连接肽。PETase-MHETase融合蛋白在大肠杆菌体内的稳定高效表达一旦成功建立，对于治理合成塑料污染和海洋塑料微粒有难以预计的价值，将大大改善我国垃圾处理方式不善的现状，让被塑料污染的土地重新具有肥力，节约用于垃圾焚烧所消耗的能量。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1. 研究方法

研究方法包括：文献查阅、分子生物学相关软件的模拟、分子生物学操作技术、基因操作技术、核酸工程技术及蛋白质工程技术等。

2. 技术路线和实验方案如下：

A． PETase-MHETase融合蛋白的设计

查阅PETase及MHETase的genbank序号发现相关蛋白质结构，得到PETase具有PET降解功能的特定多肽序列和MHETase的相关序列，使用基因编码的DNA序列将两者合成。将第一个蛋白的终止密码子删除，通过连接肽接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，实现两个基因的共同表达，将PET完全降解为二氧化碳和水。

B． PETase-MHETase融合蛋白表达载体的构建

①PCR反应扩增融合蛋白基因片段

对PETase和MHETase的功能基因序列进行克隆：根据碱基序列的互补原则，设计合适的引物，运用AFEAP（Assemblyof Fragment Ends After PCR）、体内同源重组（IVA cloning）和T5外切酶依赖组装（利用T5外切酶和同源臂的DNA片段组装）等新型基因分子操作技术将PETase序列、连接肽和MHETase序列进行PCR克隆并组装在一条基因片段上，形成融合蛋白基因。

②融合蛋白基因与载体的连接反应

对融合蛋白基因片段和载体进行重组：通过限制性内切酶在特定碱基序列位点上的作用，对DNA片段进行酶切，用连接酶将具有相同末端的酶切位点基因片段进行体外连接，并克隆到高效表达质粒载体上，构成融合蛋白重组质粒。（若传统基因操作技术不足以克服酶切或连接上的困难，试采用同源臂DNA片段组装的新型DNA技术，但该技术为国外新型发明技术，实际操作上可能面临更多未知的困难）

③融合蛋白质粒的鉴定及PCR、基因测序

将融合蛋白重组质粒转入一系列感受态细菌中，进行抗生素平板涂布，鉴定重组质粒中的抗性标记是否表达成功，对表达成功的质粒进行PCR反应（DNA链式聚合酶反应）。扩增目标融合蛋白重组质粒，提取重组质粒并送相关测序机构测序，保留具有较高正确率的质粒等待进一步导入受体菌中诱导表达。

C． PETase-MHETase融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达

以大肠杆菌作为受体菌株，选取合适的表达系统（Lac乳糖操作子表达系统或Trp表达系统等），对融合蛋白重组质粒进行稳定高效的诱导表达。

3. 可行性分析

⑴ 理论可行

通过前期的文献查阅，已经对本课题的研究内容有了初步的基础知识积累。在微生物遗传育种、分子生物学、细胞生物学、生物化学、生物分离实验等课程中接触过本课题相关知识，并且在实习中正式独立操作与进阶学习过，有较好的理论基础。

⑵ 方法与技术可行

本课题拟采用的方法与技术有：基因工程技术、蛋白质工程技术、微生物学等，结合国内外相关文献知识，这些方法知识均在本科相关课程中有涉及，且符合本次毕业论文要求，有充分的可行性。

⑶ 研究力量与设备可行性

食品科技学院酶工程实验室有充足且完善的设备供应与专业知识丰富的学姐学长，设备及操作可行性充分。指导本毕业论文的陈美容老师主要从事酶工程相关研究，曾在日本与美国留学，具有扎实的专业知识与国际化视野，能够在学术上保证本实验的研究水平。

特色或创新之处

本实验涉足近年来兴起的酶的塑料生物降解领域，结合生物工程本科所学与所需技术素养，广泛阅览国内外最新研究进展，通过本科所学知识与操作，加之文献新方法的运用与老师的指导改善，运用分子生物学操作手段完成塑料降解酶融合蛋白的重组表达。目前，国内还未有此类关于塑料降解酶的融合蛋白研究。该课题不仅在酶生物降解塑料的领域独树一帜，而且研究前景广泛也极具意义，对国内与日俱增的塑料污染老大难局面有一定的缓解甚至改善作用，还可以用于海洋生态系统的改善。最后，通过PETase-MHETase融合蛋白重组菌的稳定高效表达与连接肽的优秀选型，完成此毕业论文。