变性淀粉对乳化肠消化率的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1课题的意义

淀粉是肉制品中使用最广泛的添加剂之一，主要是由于淀粉具有很高的膨胀和持水能力，可增强肉制品的凝胶强度、减少肉的用量，同时还能提高肉制品的稳定性^[1]。由于肉制品工业的快速发展以及消费者对肉制品品质的需求，原料淀粉的添加已经不能满足肉制品逐渐提高的产品品质标准，因此改性淀粉在肉制品中逐渐取代了原料淀粉，继承了原料淀粉诸多特性的同时，赋予肉制品天然淀粉所不能提供的诸多功能特性，如耐热性、耐酸性、糊化稳定性、抗老化性和抗剪切性等^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1研究目标

（1）探究不同淀粉添加量对乳化肠的物理性质的影响

（2）探究不同淀粉添加量对乳化肠蛋白消化率的影响

3. 研究的方法与方案

1研究方法

采用色差仪对乳化肠的L*、a*、b*进行测定；采用质构仪对乳化肠的内聚性、弹性、胶粘性、咀嚼性进行测定；采用凯氏定氮法测定粗蛋白的含量，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白；采用粒径分析仪分析样品颗粒大小；采用全自动氨基酸分析仪测量样品中游离氨基酸的含量；采用紫外分光光度计测定样品中的肽含量；实验数据采用IBM SPSS Statistics软件分析差异显著性检验。数据分析过程中，多重比较釆用邓肯多重比较测试，采用单因素方差分析进行样品均数间的比较。

2技术路线

3实验方案

3.1鳄鱼肠的制作

3.1.1制作配方

表1乳化肠的制作配方

按照表1制作三组淀粉含量不同的乳化肠。

3.1.2制作步骤

（1）绞制：猪肉均采用孔径4mm的筛板绞制，绞制后肉温≤4℃

（2）斩拌：先将绞制好的猪肉、豆粉和1/3的冰水投入斩拌机，高速斩拌（刀高速、锅高速）成细腻的泥状（3min），待肉温升至4℃时加入1/2的冰水、绞制好的猪肉和其它辅料高速斩拌(3min)，待肉温升至4℃时再加入剩余的冰水，继续高速斩拌至肉温升至7℃时(4min)。

（3）灌装：采用灌装机进行手动灌装，防止气泡

（4）蒸煮：80℃ 15分钟

（5）散热：蒸煮后将产品推入散热间散热，待产品中心温度降至≤15℃时方可下架包装。

（6）包装：真空包装，4℃贮藏。

3.2鳄鱼肠的物理性质的测定

3.2.1蒸煮损失率测定

蒸煮损失用蒸煮前后水分和脂肪的损失总量占原重的百分比表示。分别称量蒸煮前乳化肠的质量以及蒸煮冷却后拭去肠衣表面水分的乳化肠的质量^［22］。重复测定 3 次，取平均值。蒸煮损失按式( 1) 计算:

CL = （m₁- m₂）/ m₁× 100% ， ( 1)

式中: CL---蒸煮损失，% ；

m₁---蒸煮前乳化肠的质量，g；

m₂---蒸煮后乳化肠的质量。

3.2.2含水量测定

参照汪岩^[23]的方法，稍作修改。取10g左右乳化肠，切成碎屑，放入称量皿中精确称量, 计肠质量m₁，称量皿及肠质量m₂，放入105℃恒温干燥箱中，烘 3h后精确称量皿及肠质量m₃，每批样取3个平行样，计算平均值。

含水量按（2）计算：

含水量=（m₂-m₃）/m₁× 100% ，（2）

式中: m₁---烘前乳化肠的质量，g；

m₂---烘前皿和乳化肠的质量，g；

m₃---烘后皿和乳化肠的质量，g。

3.2.3色差测定

参照乔丽娟^[10]将乳化肠切成大小一致的正方体( 边长为 2 ～ 3 cm) ，用色差计来测定其内部颜色变化。对色差计进行校标和校零后，任选 3 个表面测量和记录乳化肠的 L ( 亮度) 、a( 红色) 、b( 黄色) 值。重复测定 6 次，取平均值。

3.2.4质构测定

乳化肠的TPA测定参照刘迪迪等^[24]的方法。

乳化肠预处理：将4℃贮藏的乳化肠在室温下放置，使其温度达到室温 (20~22℃) ，剥去肠衣后，用平行刀将其切成2cm长的圆柱，切面要平整垂直，每批样选取6个平行乳化肠用于TPA测定。

设置测试参数为：选用P/50探头，测试前速率:2mm/s，测试速率：1mm/s，测试后速率:1mm/s，压缩比为20%，两次激活感应力：5g，TPA结果采用Stable Micro System软件分析，测定的质构参数包括硬度、粘着性、弹性、粘聚性、咀嚼性、回复性。

3.3体外胃肠模拟消化实验

3.3.1消化样品制备

体外模拟体内胃肠逬消化试验根据Wen等^[25]的方法，并稍作修改。称取每份样品4.00g，加入16mlPBS(pH7.4)，在冰浴下匀浆，匀浆30s重复四次，每次匀浆间隔30s。

3.3.2体外胃肠模拟消化过程^[26]

（1）胃消化液的配置

表2 胃消化液配方

按照上表配置胃缓冲液，用2mol/L的HCl调节pH至1.6，取20mL胃缓冲液，加入胃蛋白酶和胃粘液素，混匀后在37℃恒温水浴锅中水浴25min。

（2）肠缓冲液及肠消化液的配置

表3肠消化液配方

按照上表配置胃缓冲液，用2mol/L的HCl调节pH至7.0，取20mL胃缓冲液，加入胰液素和胆盐，混匀后在37℃恒温水浴锅中水浴25min。

（3）消化

①胃消化

打开模拟消化系统，调整胃倾斜角为8°，系统温度38℃，进行预热。设置消化参数为胃挤压装置3cpm，胃滚轮装置12cpm，肠滚轮装置0cpm，排空泵装置70μL/min,胃液注射泵52μL/min,胰液注射泵0μL/min。向3D打印的鼠胃中加入0.6mL模拟胃液和5-6mL匀浆液，开始消化。

②肠消化

打开模拟消化系统，调整胃倾斜角为8°，系统温度38℃，进行预热。设置消化参数为胃挤压装置3cpm，胃滚轮装置12cpm，肠滚轮装置12cpm，排空泵装置100μL/min,胃液注射泵52μL/min,胰液注射泵52μL/min。向3D打印的鼠胃中加入0.6mL模拟胃液和5-6mL匀浆液，开始消化。

（4）取样

离开胃的样品即视为胃消化完成，离开肠的样品视为肠消化完成。称量取样用的离心管并做好标记，每半小时取样一次，取样后立即沸水煮3-4分钟，放入-20℃冰箱中中断酶反应，总消化时间为3h。

3.4蛋白含量测定

3.4.1粗蛋白含量测定

采用凯氏定氮法^[27]

（1）盐酸标准滴定液(0.0500mol/L)配置：标定好的盐酸标准溶液(0.100mol/L)移取50.00m L定容至100m L容量瓶中。

（2）试样处理：称取0.2g~2.0g固体试样、半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g,(精确至0.001g)于定氮瓶中，加入0.2g五水硫酸铜(AR)、6g硫酸钾(AR)做混合催化剂，再加入20m L硫酸和2粒玻璃珠，于电炉上加热，小火加热炭化,泡沫停止后加大火力，至溶液呈蓝绿色透明后再加热0.5h~1h。冷却，小心转入100m L容量瓶,加水定容至刻度，混匀备用，同时做试剂空白。

（3）样品测定方法:装好定氮蒸馏装置，向接收瓶加10.0m L硼酸溶液(20g/L)及2~3滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，准确吸取2.0m L~10.0m L试样处理液,加10.0m L氢氧化钠溶液(400g/L)，通入蒸气10min，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min，用盐酸或硫酸标准滴定溶液滴定至溶液由绿色变成酒红色为终点。同时做试剂空白试验。

根据测量原理及方法,测量结果按照式（3）计算:：

X=140×（V₁-V₂）×c ×F/(m×V₃) ,(3)

式中：X----试样中蛋白质的含量(g/100g)；

V₁---试样消耗盐酸标准滴定溶液的体积(mL)；

V₂---试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积(mL)；

V₃---吸取消化液的体积(mL)；

c---盐酸标准滴定溶液浓度(mol/ L)；

0.0140-1.0m L盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量(g)；

m---试样质量(g)；

F---氮换算为蛋白质的系数，本实验为6.25(其他换算系数按标准中说明)

3.4.2可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法[28]测定可溶性蛋白含量。称取1.00 mg牛血清白蛋白加1 m L去离子水配制成质量浓度为1.00 g·L-1的标准溶液，称取10.00 mg考马斯亮蓝G-250粉末加入5 m L 95%乙醇和10 m L 85%磷酸, 加去离子水定容至100 m L，得到考马斯亮蓝溶液。取6支试管，其中，1支加0.1 m L蒸馏水作为空白对照，其余5支分别用移液枪移取不同体积 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L) 的1.00 g·L-1牛血清白蛋白标准溶液并且补加蒸馏水至1 m L。6支试管分别加入4 m L配制好的考马斯亮蓝溶液，混合均匀，静置5 min。在紫外-可见分光光度计595 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

样品溶液的制备和考马斯亮蓝法测定：消化液离心（10000g，10min，4℃），取消化30min、60min、90min、120min、150min、180min的乳化肠消化液上清液0.01mL,加水至1 mL于试管中，加入4mL考马斯亮蓝，摇匀，静置反应5min。采用玻璃比色皿在紫外-可见分光光度计595 nm处测得吸光度。用所得的吸光度从标准曲线中查得相当于牛血清白蛋白的微克数，以计算样品中所含的可溶性蛋白含量。

3.4.3蛋白消化率的测定^[29]

消化前的乳化肠匀浆液和消化后的混合物离心（10000g，10min，4℃），弃去上清液。在50℃的条件下，将沉淀烘干至恒重，并记录数据，用凯氏定氮法测定消化前后乳化肠烘干的残留物中蛋白质含量。消化率计算方程按照公式（4）：

DT（%）=（W₀-W₁）/W₀× 100%，（4）

其中，DT为蛋白质体外消化率，

W₁为消化后烘干沉淀物中蛋白质的含量（g），

W₀为消化前肉样中蛋白质的含量（g）。

3.5聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

3.5.1上样样品的制备

消化前后的样品，离心（10000g，10min，4℃）取上清。以2:1的比例和上样缓冲液混合，混匀后沸水中煮5min备用。

表4上样缓冲液配方

上样缓冲液按照表4配置，于4℃冰箱保存。

3.5.2 SDS-PAGE电泳

（1）分离胶的配置

按照表5配置12%的分离胶，混匀后加入板间隙，加到距离板顶部1cm处停止，并在上部用水进行水封。静置40min以上，至分离胶凝固，将上部的水倒掉。

表5 12%分离胶配方

（1）浓缩胶的配置

按照表6配置4%的浓缩胶，充分混匀后加入到分离胶上部的缝隙中，并插入梳子。静置40min以上至浓缩胶凝固，轻轻拔出梳子。

表6 4%浓缩胶配方

（2）上样

取10-30μL配置好的样液，加入到孔中，并在每块胶中加入2μL的marker作为参照。

（3）设置电泳参数

预电泳电压80 V，时间40min；进入分离胶后调到120 V，时间，直到溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。

3.5.3考马斯亮蓝染色

电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色2 h，之后用脱色液脱色12 h以上，采用Tanon 1600凝胶成像系统拍照。

3.6肽含量测定

参考Church等^[30]的方法并稍作改进。采用10 kDa超滤膜过滤样品，取50 μL样品溶于2 mL邻苯二甲醛混合溶液混合，室温下避光精确反应2 min，于340 nm处测定紫外下吸光值。用酪蛋白作为标准物配制梯度溶液并测定吸光值，绘制标准曲线以由此计算粗肽液中粗肽含量。

酪蛋白标准曲线：

邻苯二甲醛混合溶液配制：取80 mg的邻苯二甲醛溶于2.0 m L甲醇溶液，依次加入50 m L 100 mmol/L硼砂 (十水合四硼酸钠) 溶液、5.0 m L 20%质量分数的十二烷基硫酸钠 (SDS) 和200μLβ-巯基乙醇，用去离子水调至总体积为100 m L。

3.7游离氨基酸含量测定^[31]

取消化后的样品上清液2 mL加入8%磺基水杨酸溶液2 mL，在4℃冰箱里静置30 min后，在10000 r/min离心10 min，取2 mL离心后的上清液，加入2 mL正己烷，混合后在10000 r/min离心10 min，取下层液体，过0.22μm滤膜后进氨基酸自动分析仪测定。

3.8数据分析

实验数据采用IBM SPSS Statistics软件分析差异显著性检验。数据分析过程中，多重比较釆用邓肯多重比较测试，采用单因素方差分析进行样品均数间的比较。统计学P0.05表示样品间差异显著，P0.05为差异不显著。

4可行性分析

4.1实验技术的可行性

乳化肠的制作具有十分成熟的加工技术，其配方和制作方法均有较多研究。体外模拟消化技术虽然是新兴的研究技术，但目前也有诸多报道和研究，其技术也日渐成熟。实验所用的凯氏定氮法、考马斯亮蓝法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等实验方法是基本的实验方法，具有十分准确和成熟的研究。

4.2实验仪器的可行性

依托国家肉品中心一楼加工中心，有良好的实验条件进行乳化肠的制作和储藏。食品微生物实验室具备体外模拟消化系统，具有成熟的消化体系。

4. 研究创新点

（1）乳化肠尝试使用不常见的鳄鱼肉作为主要原料来制作，在原料利用方面具有创新性。

（2）模拟消化采用体外动态模拟消化法，模拟胃为3d打印鼠胃，并有模拟挤压、蠕动的胃滚轮和胃挤压装置，肠道配有肠滚轮装置，模拟肠道的蠕动。动态的模拟消化，比静态的消化更接近体内消化，实验结果更具可信度。

5. 研究计划与进展

1研究计划

2预期进展

2.1乳化肠的物理性质

随淀粉添加量的升高，乳化肠的质构特性发生改变，特性更加优良。

2.2乳化肠的消化率

随淀粉添加量的不同，乳化肠的消化率发生一定变化。