1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本课题的意义
茶树在中国已经有上百年的历史，茶树花是其生殖器官之一，每年的茶树花产量很高。目前，茶树的研究利用主要集中在叶片，对茶树花的研究较少。近年来，随着对茶树花研究的不断增多，发现茶树花具有大量的氨基酸、茶多糖、茶多酚及蛋白质等生化成分。同时研究发现，茶树花在抗氧化、增强免疫力、抗癌、降血糖血脂以及抑菌等方面具有突出的保健功效。许多学者已经证实茶多糖具有多种的生理功能，但鉴于国内外对茶树花多糖的研究报道较少，所以本文重点研究茶树花多糖的结构以及活性，通过对茶树花多糖的提取以及纯化来对其结构和活性进行解析研究。
2 研究概况
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标：本课题的目的主要是研究初步纯化的茶树花多糖的初级结构，包括纯度、相对分子质量、单糖组成和红外光谱分析以及茶树花多糖的生物活性，包括体外抗氧化、体外抗肿瘤等。
2、研究内容：主要有结构方面（1）：茶树花多糖的分子量；（2）：茶树花多糖的单糖组成；（3）茶树花多糖的红外光谱分析等。生物活性方面（1）：体外抗氧化活性；（2）：体外抗肿瘤活性。
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法：
采用DEAE-纤维素柱层析初步分离粗多糖，后将分离所得三种不同产物组分分别收集且通过减压旋蒸的方法进行浓缩，后通过透析袋去除杂质，通过冷冻干燥得到目标产物。在已经获得的目标产物基础上，对其分别进行理化分析，纯度及分子量的测定。实验最后对数据进行分析及讨论。
2. 技术路线：
粗多糖→离子交换层析→合并旋蒸浓缩→冷冻干燥→测定
3. 实验方案：
3.1 前期准备预处理
（1）DEAE-纤维素凝胶预处理
准确称取DEAE-纤维素凝胶干粉100g，加入15倍体积质量比（mL/g）的0.5mol/L NaOH溶液，浸泡0.5h→用去离子水反复浸洗至pH值中性→再用同体积0.5mol/L HCL溶液浸泡0.5h→用去离子水反复浸洗至pH值中性→最后用相同体积0.5mol/L NaOH溶液浸泡0.5h→用去离子水反复浸洗至pH值中性
DEAE-纤维素凝胶处理完毕后，进行湿法装柱，然后依次用去离子水，0.5mol/L NaCl和去离子水流洗已装好的凝胶柱各12h，洗液流速设均为1.0mL/min，层析柱平衡24h备用。
（2）初产物的收集
DEAE-纤维素凝胶预处理完成后，计划日程开始收集初级产物。
准确称取50mg虫草富硒多糖溶于3mL去离子水中，加样于DEAE-纤维素层析柱(2.6×30cm)中。用不同浓度的NaCl溶液依次洗脱（分别为0.0mol/L，0.1mol/L，0.3mol/LNaCL溶液），设定洗脱液流速为1.0mL/min，并用自动部分收集器分布收集不同浓度洗脱液对应的流出液，换管频率为10min/管。这部分实验中利用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。
3.2 后期测量：多糖含量，蛋白质含量，糖醛酸含量，纯度，分子量及基团结构
3.2.1多糖含量
①制作标准曲线：准确称取105℃烘干至恒重的葡萄糖10mg于100ml的容量瓶中配制成0.1mg/ml的标准溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管，补水至1ml，分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的溶液。分别加入5%苯酚溶液1ml，并迅速加入浓硫酸5ml（加入试剂的量见下表），静置10min。摇匀，放置30min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 葡萄糖标准液（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 5%苯酚溶液（ml） | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 浓硫酸（ml） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 葡萄糖标准液（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 5%苯酚溶液（ml） | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 浓硫酸（ml） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
②样品含量测定：配置适当浓度的样品溶液，取1.0ml，按照上述方法测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算样品中总糖含量。
3.2.2蛋白质含量
①制备标准曲线：准确称取牛血清白蛋白10mg，用蒸馏水溶解后定容至100ml，配制成0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。称取100mg考马斯亮蓝G-250，用50ml乙醇（95%）充分溶解，然后加入100ml磷酸溶液（85%），用去离子水定容至1000ml，配制得到考马斯亮蓝G-250工作液；取6支洁净试管并编号，分别加标准蛋白质溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，用去离子水补至1.0ml，各管加入考马斯亮蓝G-250工作液5.0ml，震荡混匀，10min后于分光光度计595nm处测定吸光值。以试管中牛血清白蛋白微克数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制牛血清白蛋白标准曲线。
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 蛋白质标准溶液（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 考马斯亮蓝G-250试剂（ml） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
3.2.3糖醛酸含量
①制备标准曲线：分别取60μg/ml的葡萄糖醛酸溶液0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25ml于带塞试管中，用蒸馏水补至0.25ml。在冰浴中预冷后加入1.5ml四硼酸钠-硫酸溶液（0.0125mol/ml）。震荡混匀，沸水浴中加热5min。冰浴中冷却至室温后，微量加入25μg间羟联苯溶液（0.15%，用0.5%氢氧化钠溶液配制）。混匀后在520nm处测定吸光值。以试管中葡糖糖醛酸微克数为横坐标，520nm处吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖醛酸标准曲线。
②样品含量测定：配制适当浓度的样品，取0.25ml，按照上述方法测定吸光值，根据葡萄糖醛酸标准曲线，计算样品中葡萄糖醛酸含量。
3.2.4纯度及分子量
采用HPLC进行检测。
(1)分子量标准曲线的制备：将已知分子量的标准多糖（分子量分别为5900Da，11800Da，22800Da，112000Da的葡聚糖）用流动相配成1.0mg/ml标准溶液，经0.45μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。具体操作条件如下：流动相为含0.1mol/LNaSO4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。流动相流速为0.8ml/min。色谱柱和检测器温度均为25℃。进样次序按分子量由小到大进行进样，进样体积为20μl，记录示差色谱图的保留时间（T）。以标准多糖分子量的对数值（lgM）为纵坐标，色谱图上的保留时间为（T）为横坐标作图，得多糖分子量的标准曲线。
(2)样品多糖平均分子量的测定：称取多糖样品配制1.0mg/ml溶液，0.45μm滤膜过滤，相同条件下进行高效液相色谱分析，记录样品色谱图的保留时间T值。
根据多糖分子量标准曲线和多糖样品在色谱图上的保留时间可计算出多糖样品的平均分子量。根据多糖样品在色谱图上峰的数目和形状对多糖的纯度进行鉴定。
3.2.5红外光谱分析
多糖样品的红外光谱分析，采用KBr压片法。
样品制备方法：首先将事先充分干燥的分析纯KBr用玛瑙研钵研磨至2μm以下，称取100~200mg溴化钾（KBr）粉末，充分干燥，并用压片机压成薄片。称取1~2mg经冷冻干燥的多糖样品，与已干燥的KBr粉末在研钵中研磨均匀，用压片机压成薄片。用不加多糖样品的KBr薄片进行空白试验调整基线，再将含多糖样品的KBr薄片进行红外光谱扫描，扫描范围为4000cm-1~500cm-1。
4. 茶树花多糖体外抗氧化活性研究
4. 1 DPPH·自由基清除活性测定
取不同浓度的样品(粗TFPS, TFPS-1, TFPS-2和TFPS-3)溶液1.0 ml于试管中，分别加入0.3 ml DPPH}溶液(0.4 mmol/L )，再加入2.0 ml水。混匀反应体系，避光保存3 0 min后于分光光度计517 nm处测吸光值。以Vc作为阳性对照。DPPH溶液用无水乙醇配制。以水代替TFPS溶液、无水乙醇代替DPPH}溶液，作空白实验调零用。清除效果依下面公式计算:清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0*100％其中:A0为对照实验(水代替TFPS溶液)的吸光值;A1为样品实验的吸光值;A2:为样品干扰实验(无水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。
4.2清除超氧阴离子自由基活性测定
取不同浓度的样品(粗TFPS, TFPS-1, TFPS-2和TFPS-3 )溶液1.0 ml于试管中，分别加入1.0 mlNBT溶液(156mol/L), 1.0 ml NADH溶液(468mol/L)和1.0 mlMS溶液(60 }mol/L )。混匀反应体系，25℃水浴5min，于分光光度计560 nm处测吸光值。以Vc作为阳性对照。NBT溶液、NADH溶液和PMS溶液均用0.2 M pH=7.4
磷酸盐缓冲液配制。以水代替TFPS溶液、0.2 M pH=7.4磷酸盐缓冲液代替NBT溶液，
作空白实验调零用。 清除效果依下面公式计算:清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0* 100%其中:A0为对照实验(水代替TFPS溶液)的吸光值;A1为样品实验的吸光值;A2为样品干扰实验( 0.2 M pH=7.4磷酸盐缓冲液代替NBT溶液)的吸光值。
5. TFPS各组分体外抗肿瘤活性的研究
5.1 TFPS各组分对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用
（1）取对数生长期的BGC-823细胞，按细胞传代的方式制备悬浮细胞，调整细胞浓度为1x105个/mL, 100μL/孔接种于96孔板，四周的孔不接种。（2）37℃，5% CO2培养箱培养12 h。（3）细胞贴壁后，用移液管小心吸出上清液，再每孔加样100 μL，样品浓度为25,50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL，每个浓度设5个复孔，空白对照为DMEM完全培养基，阳性对照为50 μg/mL的五氟脲嘧啶。（4）将上述处理的96孔板置于37℃ , 5% CO2培养箱培养，培养24, 48, 72 h时，分别取出96孔板，移液管小心吸出上清液，每孔加0.5 mg/mL的MTT, 200μL/孔，继续在37℃ , 5% CO2培养箱培养4h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL，震荡5 min后于570 nm波长处测吸光度值。（5）细胞存活率的计算公式如下:细胞存活率%=(A样品/A对照)x100%
5.2 TFPS各组分对人肝癌细胞HepG2的抑制作用
(1)取对数生长期的HepG2细胞，按细胞传代的方式制备悬浮细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，100μL/孔接种于96孔板，四周的孔不接种。(2) 37℃，5% C02培养箱培养12 h。(3)细胞贴壁后，用移液管小心吸出上清液，再每孔加样100μL，样品浓度为25, 50, 100, 200, 500, 1000μg/mL，每个浓度设5个复孔，空白对照为DMEM完全培养基，阳性对照为50μg/mL的五氟脲嘧啶。 (4)将上述处理的96孔板置于37℃ , 5% CO2培养箱培养，培养24, 48, 72h时，分别取出96孔板，移液管小心吸出上清液，每孔加0.5 mg/mL的MTT, 200μL/孔，继续在37℃, 5% CO2培养箱培养4h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL,震荡5 min后于570 nm波长处测吸光度值。(5)细胞存活率的计算公式如下:细胞存活率%=(A样品/A对照)*100％
4、可行性分析：主要运用一些基本实验方法，操作简单，需要的条件也较容易达到，原料和试剂购买方便，价格适中，符合经济效益最大化要求。实验所需器材基本都为实验室常用仪器试剂，实验室已基本具备。
4. 研究创新点
目前有关茶树花和茶多糖的研究越来越多，但将两者结合的研究却相对较少，随着人们养生意识的加重，会越来越注重营养及健康，本实验的研究可以拓展食品业及生物制药等行业的空间。
5. 研究计划与进展
| 序号 | 计划时间 | 研究计划 | 预期进展 |
| 1 | 2019年11月 | 查阅文献 | 提交文献综述 |
| 2 | 2020年2月下旬 | 前期实验 | 确定得到不同组分的目标产物 |
| 3 | 2020年3月下旬 | 后期实验 | 确定测定其各项理化性质及结构分析 |
| 4 | 2020年4月上旬 | （部分）重复实验 | 确定结果准确性 |
| 5 | 2020年4月到5月 | 撰写论文，准备答辩 | 完成毕业论文 |
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