1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献） 1.选题意义 我国是农业大国，年产秸秆量在亿吨以上，虽然产量巨大，但其利用率较低，在粮食总产量已经跃居世界前列的同时也产生了大量的作物秸秆和养殖业的畜禽粪便等农业废弃物，每年的产量分别高达约7.8亿吨和40亿吨[1]。本来是资源的废弃物随地丢弃处置，不仅占据耕地面积，而且严重污染环境。我国常年秸秆焚烧量占秸秆总量的 10%-15%秸秆焚烧这一状况严重污染大气环境，造成了严重的雾霾以及空气质量的下降，火灾事故频发等生态环境和社会经济问题[2]。因此秸秆资源化利用问题已经成为我国目前的科研热点之一。农作物秸秆“用则宝，弃则害”，如何将秸秆变废为宝，涉及到整个农业生态系统中的土壤有机质转化、土壤肥力、土壤墒情以及可再生资源利用等一系列农业问题，由此可见秸秆资源化利用是当前农业可持续发展的必然要求[3]。秸秆中还含C、N、P、K、Ca、Mg、S和Si等多种矿质营养元素，若将其中的矿质营养全部或部分转化为作物可吸收利用的营养成分，则可为作物提供丰富的矿质元素从而减少化肥使用量[4]。秸秆总量华北和长江中下游地区较多，分别占全国总量的26.4%和26.2%[5]。低温是制约北方寒冷地区秸秆生物持续、高效转化的主要因素。因此在低温条件如何降解纤维素成为了生物技术处理有机固体废弃物的关键[6]。 目前，堆肥处理为最常用的解决方法，通过接种纤维素降解菌，能够有效地降解纤维素含量[7]，提高堆肥效率，更有效地实现有机质矿化［8］。秸秆的C/N比有点高，在堆肥过程中分解性较差。由于这些材料中常含有不利于作物生长的有害物质，如果要使它们较好地进行分解则需要很长的时间，这样会增加堆肥处理设施面积和增加处理成本。低温下堆肥起温是决定堆肥迅速进入高温期、实现无害化的关键[9]。低温下，中温菌和高温菌很难正常生长繁殖，降解堆肥中的大分子有机物质［10］。因此，低温菌就成为了一个研究重点。 因此本实验主要进行低温纤维素降解菌株的筛选和复配菌剂的研究，其应用有利于保持堆肥中微生物活性，降低肥料中的纤维素含量和抑制杂菌的感染，还对于进一步解决秸秆纤维素资源肥料化，改善土壤结构和保护自然环境等问题有着重要意义。 2.国内外研究状况 早前，研究已证明微生物在堆肥过程中发挥着重要作用，从堆肥中分离培养可获得大量的纤维素分解菌，包括真菌、放线菌和细菌[11-13]。已报道的低温秸秆降解菌既
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| 有嗜冷菌又有耐冷菌，一般最适生长温度在10-25℃，多数不能在超过 37℃的条件下生长［14］，嗜冷菌和耐冷菌能够在低温下生产和保存适当的新陈代谢产物，并且参与代谢的酶在低温下具有高效的催化活性，有利于加快分解速率，缩短堆肥周期。在以往的堆肥纤维素分解菌研究中，低中温纤维素分解菌和单一菌株对堆肥进程的影响已取得较多成果[15-17]。如钱林等从黄浦江水底沉积物得到的纤维素降解菌株在37℃、pH=7时酶活最高[18]。李振红等从腐木、腐竹等样品中筛选获得4株高效纤维素降解菌，其中3株为真菌[19]。 目前报道中关于低温纤维素酶生产菌研究较少。袁楠等筛选出一组低温纤维素降解菌系[20]。亢宗静等研究若尔盖高原湿地低温真菌特征，发现两株低温纤维素降解菌分别为白囊耙齿菌和烟曲霉[21]。谢宇新等筛选出纤维素低温降解菌D5属于假单胞菌属，在低温堆肥升温过程中起重要作用[22]。因此，筛选产纤维素酶活性高，适应自然环境能力强菌株，对纤维素资源降解利用意义重大[23-24]。本研究利用限制性培养方法，在山东某堆肥厂原料中筛选出耐低温、高效解纤维素降解菌株，命名为DW-1，并以其为研究对象，利用形态学研究方法和ITS序列分析确定菌株菌属，研究了菌株产纤维素酶条件及其酶学性质，为低温纤维素降解菌应用奠定理论基础。 3.应用前景 在微生物腐熟菌剂的研究方面，越来越多的学者将获得的一些纯培养菌株进行优化组合，然后制成微生物复合菌剂使用，本实验获得的低温高效纤维素降解菌可扩大高效纤维素降解菌库，为高效菌群的构建提供材料，大大提升堆肥腐解效果；此外，利用高效纤维素降解菌剂,尤其是复合菌剂，可降解大部分的纤维素类物质，将其转化为工业材料，在多个领域有所应用，具有较大的发展潜力[32-33]，有利于节约费用和资源；此外，降解秸秆等将有利于提高土壤肥力和改善土壤环境，符合生态保护的要求。 |
2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 1.研究目标 从堆肥的低中温阶段中取样，通过连续传代富集的方法获得低温纤维素降解菌，并验证降解效果，从中挑选出降解率高的菌株进行后续阶段的复配研究。通过与实验室已筛选的其它温度的高效纤维素降解菌进行复配，模拟堆肥体系的最佳复配组合。 2.研究内容 2.1从样品中获得低温纤维素降解菌； 2.2复筛获得高效的低温纤维素降解菌株； 2.3低温纤维素酶活测定； 3.拟解决的关键问题 3.1能否筛选出10℃高效分接纤维素的秸秆降解菌； 3.2确定低温降解菌株及其纤维素酶学性质。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1.研究方法 1.1文献法：根据研究课题调查与低温纤维素降解菌有关的文献，包含降解原理、研究现状、研究方法等，依据收集到的资料对低温纤维素降解菌及其原理有较为详细的认知，并且制定较为详细、可靠、可行的实验方案来获得低温高效纤维素降解菌。
1.2实验法：通过控制条件、减少或消除各种可能影响科学的无关因素的干扰，在简化、纯化的条件下获得纤维素降解菌，后通过复筛等过程，获得高效纤维素降解菌。降解能力采用秸秆降解试验。 |
| 2.技术路线
3.实验方案 3.1低温纤维素降解菌的初筛：将10g堆肥样品加入含90mL无菌水的三角瓶中，于170r/min、10℃的摇床中振荡2h，静置30min，吸取1mL上清液于含9ml无菌水的试管中，依次稀释得到10-5、10-4、10-3，然后取每个稀释度的稀释液200μL涂布于刚果红培养基上，每个稀释度3个重复，将平板置于10℃中恒温培养7d，挑取形成明显透明圈的单菌落进行分离纯化. 3.2低温纤维素降解菌的复筛：将1%菌株接种量至液体发酵培养基中，以2%的2-3cm的水稻秸秆段为碳源，10℃、170r/min培养7d，每个处理3个重复。降解结束后，将秸秆残渣转移至100目尼龙网袋，使用清水将秸秆表面附着的菌丝及其它可溶物清洗干净，残渣于65℃下烘干至恒重，称量秸秆残留物干重，计算秸秆降解率（DR）。对照组以等量无菌水替代，其余步骤相同。选取DR最高的菌株冷冻保存做后续实验。 DR=（m0-m1）/m0×100% （m0：对照组残渣干重 m1：处理组残渣干重 ） 3.3菌株的鉴定：细菌采用形态、生理生化及16SrRNA序列比对进行鉴定；真菌采用形态及核糖体DNA内转录间隔区（ITS）区序列比对进行鉴定。扩增引物合成和16SrDNA序列测定均由南京金斯瑞生物技术服务有限公司完成，测定结果在Gen Bank 中进行同源性比较，选取Gen Bank中同源性较高序列，采用MEGA7软件进行序列
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| 比对和系统发育树构建。 3.4纤维素酶活测定： 3.4.1粗酶液的制备：配制50 mL液体无机盐培养基于150 mL三角形瓶中，添加1%的秸秆粉作为碳源配制成秸秆粉液体发酵培养基，在121 ℃高温灭菌20 min，冷却后按1%接种量接种孢子悬液（浓度为107个/ml）到液体产酶培养基，30 ℃、170 r/min 振荡培养，5d后取2 mL液体，12000 r/min 离心5 min取上清液，得到粗酶液，用于酶活测定。 3.4.2纤维素内切酶活（CMCase）活力：取0.5ml 1%羧甲基纤维素钠溶液于2ml离心管中，加入0.4ml醋酸盐缓冲液（pH5.0）和0.1ml经适当稀释的粗酶液，混匀后在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃水浴30min，结束后加入1ml的DNS试剂并立即沸水浴5min，吸取200μL反应液用酶标仪在540nm波长下测定吸光度。空白对照在100℃水浴灭活10min的粗酶液为对照酶液，其余步骤相同。 3.4.3滤纸酶（FPase）活力：在2ml离心管中加入0.95ml醋酸缓冲液（pH5.0）和1片1cm×6cm滤纸，加入0.1ml酶液于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃水浴60min，结束后立即加入1ml的DNS试剂沸水浴5min，在540nm波长下测定吸光度。空白对照为100℃水浴灭活10min的粗酶液为对比酶液，其余步骤相同。 3.4.4β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活力：在八连管中加入40 μL的 PNPG底物（10 mM），再加入50 μL的醋酸盐缓冲液（pH 5.0），最后加入10 μL粗酶液。用封口膜密封后放于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃水浴中反应10 min 后，加入100 μL 2 M 的 Na2CO3终止反应和显色。同时以灭活的发酵液做酶空白对照，最后用酶标仪在 405 nm 波长处读取吸光度值。根据标线计算出对硝基酚的含量。 3.3.5外切葡聚糖酶（cellobiohydrolase）：同β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）活力的测定。 3.3.6标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
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| 3.5菌株纤维素酶性质研究 3.5.1菌株产纤维素酶的温度适应性研究 在5℃~45℃的条件下分别测定粗酶液中的滤纸酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，研究其热稳定性。 3.5.2菌株产纤维素酶的pH适应性研究 分别在pH值为2.0~11.0的条件下测定粗酶液中的滤纸酶活、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的酶活，研究其pH稳定性。 3.5.3 不同金属离子对菌株纤维素酶活的影响 选取铁、锰、锌、铜、钾、钠、钙、镁，浓度选取0.5 mmol·L-1、1mmol·L-1、5mmol·L-1和10 mmol·L-1四个水平，以未添加金属离子的粗酶液为对照，设定对照的酶活为100%，加入金属离子的酶活性折算成相对酶活，比较金属离子对于酶活的影响。 4.实验可行性分析 4.1实验室条件充足，有一定研究基础； 4.2高效纤维素降解菌为目前的热门话题，有一定的文献参考资料； 4.3实验样品廉价易得，实验操作简单可行； 4.4 DNA检验公司为合作方，信任可靠。 |
4. 研究创新点
| 特色或创新之处 1.本采用连续低温富集的方法，使原料中的嗜冷微生物群落趋于稳定，为菌株的顺利筛选提供保证； 2.筛选出10℃下的纤维素降解菌； |
5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 2019.11—2019.12 文献阅读与知识储备 2019.12—2019.02 低温高效果秸秆降解菌的初筛和复筛 |
| 2020.02—2020.03 低温秸秆降解菌菌株的降解能力测定 2020.03—2020.05 菌株纤维素酶学性质的研究 2020.05—2020.06 数据处理与分析、论文撰写 |
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