1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 1.1课题的意义
随着现代化工业的发展，重金属废水被越来越多的排入环境中。进入水体的重金属，会破坏水体环境，抑制或毒害微生物，在水生植物和水生生物中富集，从而对人体和生态环境造成了直接或间接的危害。因此，针对水体重金属污染问题的环境修复成为了环境热点问题。目前已有大量研究表明，微生物的胞外聚合物可以通过其羟基、羧基等多种官能团与重金属相结合，达到降低重金属毒性的作用，并且因为其环保、有效和成本低廉引起广泛关注。本试验使用Cu2 、Cd2 、Pb2 、Zn2 分别培养莱茵衣藻96h后，采用扫描电镜(TEM)和透射电镜(SEM)观察受铜、镉、铅、锌胁迫后的莱茵衣藻胞内外变化过程。本试验研究可以为莱茵衣藻EPS对重金属的解毒效应提供理论依据，从而指导EPS在污水重金属处理方面的应用。
1.2国内外研究进展 1.2.1 EPS组分和功能 胞外聚合物是指分布在微生物细胞表面的一种有机高分子聚合物，相对分子质量分布范围为10×103~30×103，来源于细胞的主动分泌、细胞裂解、吸附到细胞壁表面的无机或有机化合物[1]。它结构多样、成份多样，主要成分有蛋白质、多糖、脂质、核酸、类腐殖物质和糖醛酸无机成分[2]。EPS可以在微藻细胞表面构建一个立体结构，脱水时可防止细胞脱水，同时也形成了一层保护层来抵御外界有毒物质的毒害和不利的外界环境条件，如重金属、有机化合物等。EPS在微生物群体中广泛存在，EPS不同的组分表现出不同的功能，在很大程度上决定了EPS和微生物聚集体的性质和作用。 蛋白质主要指胞外酶和结构蛋白。其中，胞外酶能降解蛋白、多糖和核酸等EPS组分，及EPS网捕的有机物，因此EPS可以为微生物的生长提供营养。还有一些重要的酶可以促进细胞附着和脱离。酶与胞外多糖的相互作用可以保护酶，防止蛋白水解或受热失活。结构蛋白则与EPS网络的形成与稳定密切相关，为宿主细胞表面和EPS之间建立联系[3]。 微藻胞外多糖的结构和组成特征可以显著影响EPS的理化性质和生物活性。葡萄糖醛酸和硫酸残基常存在于多糖的骨架中，对生物医学和抗凝血活性起着至关重要的作用。许多胞外多糖还含有多阴离子和多阳离子化合物，有助于细胞粘附和聚集。甘露糖是与铜、铅等重金属配合物有关的关键糖之一。 类腐殖物质包括腐殖酸(HA)、富里酸(FA)、腐殖质，来源于由EPS吸附的周围环境中的羰基、酚基等官能团。HA是类腐殖物质的主要成分，它和FA都是类腐殖物质的碱溶性成分，而腐殖质是不溶性残渣[4]。Wei等[5]研究了好氧颗粒污泥对Zn2 的生物吸附，发现蛋白质和类腐殖物质是EPS中负责Zn2 生物吸附的主要部分，其中类腐殖物质比蛋白质的吸附能力更弱一些。
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| 1.2.3重金属对藻类的毒害作用 工业和家庭污染源释放的重金属所造成的污染导致了水生生态系统的严重变化，导致生物多样性的丧失和食物链中有毒物质的放大和生物积累。藻类处于水生食物链的最底层，是水体环境中污染向上层营养链转移的最重要载体。此外，微藻也被用于废水的生物处理，其优势在于不产生二次污染，能使营养物质得到有效的循环利用，剩余的生物量可用于生产生物活性化合物和生物燃料，在工业规模的生物修复中具有成本效益[6]。基于生物吸附技术修复重金属污染的统计分析结果表明，藻类被用作生物吸附剂的比例比其他生物质高出15.3，比真菌和细菌高出84.6[7]。过去许多研究表明，藻类能有效地去除污水中的氮、磷以及重金属并能作为有价值的生物燃料原料[8，14]。 然而，利用微藻进行废水生物处理的过程中，金属离子同时也会对微藻产生毒性。Pinto等[20]研究表面生物体内的氧化压力可能与金属的毒性有关，包括活性氧(ROS)浓度的增加和细胞抗氧化能力的降低。氧化压力可能会导致光合作用减弱、叶绿素含量减低或细胞生长抑制。这些毒性效应可能是由于暴露在高浓度金属环境中或者较长时间暴露在低浓度的重金属环境中造成的,这反映出重金属的毒性在很大程度上依赖于剂量[19]。Baumann等的研究表明[15]，重金属(如Cu、Pb、Zn、Cr和Cd)的积累会影响某些藻类的光合作用。Tres等[21]指出,暴露于这些元素可能会阻碍许多海洋生物的生长，包括浮游植物和大型藻类，最终可能导致生物多样性的减少。Cheng等[22]研究发现，随着镉含量的增加，小球藻细胞内叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量逐渐降低。Cd浓度为3和7 mg/L的处理组，溶解性蛋白的浓度分别增加了88 和95.8 ，镉增加细胞氧化压力，诱导机体抗氧化防御系统对抗活性氧。 1.2.4EPS与重金属的相互作用 EPS是一种复杂的大分子化合物，具有复杂的立体结构，其存在的各种解离官能团包括：羟基、羧基、巯基、磷酸基和氨基等。由于这些官能团带负电，EPS可通过静电作用吸引带负电的金属离子，形成复合物[9-10]。另外溶液中的离子态重金属可以与这些官能团上的离子进行交换。钾和钙元素作为细胞的主要组成元素，随着细胞吸附Pb2 、Cu2 和Cd2 的过程中，逐渐被取代而释放到溶液中，吸附重金属离子后生物体的能量散射光谱中，出现了重金属的谱峰，而钙和钾峰消失的重要机制。Wang等[12]对生物吸附机理的研究表明，Cu2 的生物吸附与Ca2 的大量释放有关，离子交换是最重要的生物吸附机制，其他一些机制如静电吸引，也在一定程度上发挥作用。然而，Comte等[13]报道称，pH7时，来自活性污泥的EPS中Cu2 结合位点的估计数量超过了其质子交换能力(PEC)。显然，静电作用和离子交换机制并不能完全解释EPS的金属吸附行为。 EPS还有可能通过表面沉淀或氧化还原作用缓解重金属毒性。在水溶液中，金属形态及其溶解度受溶液化学性质特别是pH值的影响较大，随着pH值的增加，大多数金属离子会经历一系列的转变，从水合金属阳离子到羟基化单体、聚合体，最后在老化后形成结晶性氧化物沉淀[17]。Fang等[18]报道，在pH值大于6.6时，Cu(OH)2是Cu2 的主要形态。因此，在中性或碱性pH时Cu2 易在EPS表面沉淀。 EPS与重金属的相互作用能力与EPS组成有很大关系，蛋白组分似乎起着决定性作用。Wei等[23]研究了好氧颗粒污泥对Zn2 的生物吸附，发现蛋白质和类腐殖物质是EPS中负责Zn2 生物吸附的主要部分，其中蛋白质更容易与Zn2 结合，并进一步揭示 |
| 了蛋白质与Zn2 的反应与静态淬灭机理有关。许多研究集中在对Pb2 的去除，Pb2 的相互作用分别研究了从Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas aeruginosaN6P6和Pseudomonas pseudoalcaligenesNP103、和中提取的EPS中各功能成分所起的作用,发现不同成分对Pb2 吸附的能力有所不同，而蛋白质类物质是吸附Pb2 的最重要成分，因为其具有丰富的阴离子基团(如羟基、羧基、巯基、磷酸基等)[24-25]。Yan等[26]使用等温滴定微量热法研究EPS与重金属的相互作用机理，结果表明EPS与重金属之间的结合是是自发的，主要受焓变的驱动，且细胞外EPS中的蛋白质是结合过程的主要参与者。 根据金属离子的种类和其他特性，EPS对离子的吸附机理可能存在一定的差异。Wang等[27]研究了从Desulfovibrio desulfuricans中提取出来的EPS对重金属的竞争吸附，化学分析结果表明，不同的EPS组分对Cu2 和Zn2 吸附重金属的能力不同，且由于Zn2 可以同时与PS和蛋白质结合，而Cu2 只能与蛋白质结合，EPS与Zn2 的结合能力高于Cu2 。Sheng等[28]研究了废水处理反应器好氧和厌氧污泥EPS与Ca2 和Hg2 的相互作用，发现Hg2 与EPS的结合常数比Ca2 与EPS的结合常数高两个数量级，说明Ca2 或Hg2 与EPS的结合机制存在显著差异，Ca2 与EPS的结合主要通过静电相互作用,而Hg2 与EPS的结合主要通过络合作用。 当外源性有毒物质如重金属进入水体，水体中微生物活细胞可以产生EPS来保护自己免受毒害。然而由于EPS的组成、重金属离子的性质和水体环境等都会对EPS与重金属的作用机制产生影响，深入研究两者之间的相互作用是十分必要的。 1.3应用前景 重金属、氮磷等物质排入水体严重影响了水生生态系统，EPS作为包裹在细胞表面的复杂高分子物质，为藻类等水生生物提供了一个完整的保护层来抵御恶劣的外部环境。而EPS对污染环境中常见的各种重金属均显示出良好的吸附能力,不仅具有来源广、易制备、吸附量大、吸附迅速、吸附后结合稳定等优点，且本身不具有生物活性，吸附过程中受环境条件和重金属浓度的影响很小，能够降低使用活菌进行吸附所带来的生态安全风险，可在一定程度上弥补传统微生物吸附法的不足，是一种具有潜力的新型生物吸附剂，在工业重金属废水处理、水体重金属污染治理、重金属污染应急处置等方面有一定的应用价值。因此，有必要深入研究微藻EPS对铜、镉的响应和吸附特征，探明EPS缓解重金属毒性的作用机制，以指导藻类等生物技术在实际水污染处理中的应用。
参考文献 [1]CostertonJ W ,Cheng K J ,Geesey G G, et al. Bacterial biofilms in naturedisease[J]. Annual Review of Microbiology,1987,41(1)435. [2]Ding Z, Bourven I, Guibaud G, et al. Role of extracellular polymeric substances (EPS) production in bioaggregation application to wastewater treatment[J]. Applied MicrobiologyBiotechnology, 2015, 99(23) 9883-9905. [3]Flemming H C, Wingender J. The biofilm matrix[J]. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(9) 623-633. [4]Me T T, Yadav JS S, Yan S, et al. Extracellular polymeric substances of bacteriatheir potential environmental applications[J]. Journal of Environmental Management, 2014, 144(144) 1-25. [5]Wei D, Li M, Wang x, et al. Extracellular polymeric substances f Zn(I) binding during its sption process onto aerobic granular sludge[J]. Journal of Hazardous Materials, 2016, 301 407-415.
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2. 研究的基本内容和问题
2.1研究的目标
本试验以莱茵衣藻为实验对象，分别使用cu2 、cd2 、pb2 、zn2 培养莱茵衣藻96h后，采用扫描电镜(tem)和透射电镜(sem)观察受铜、镉、铅、锌胁迫后的莱茵衣藻细胞形态和亚细胞结构的变化，从而分析莱茵衣藻对不同重金属解毒效应的区别，以及eps在其中起到的作用，从而指导eps在污水重金属处理方面的应用。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
（1）实验法：通过sem-eds观察、tem观察等一系列实验，分析在铜、镉、铅、锌的处理下，莱茵衣细胞形貌和亚细胞结构的变化。
4. 研究创新点
4.特色或创新之处
4.特色或创新之处
5. 研究计划与进展
2020/2-2018/3选题立项，文献搜集。
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