微塑料对抗生素抗性基因转化的影响研究开题报告

 2022-01-31 21:44:05

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题意义

微塑料（mps）指通过各种途径进入生态环境中的直径小于5mm的塑料颗粒，主要包括聚乙烯（pe）、聚丙烯（pp）、聚氯乙烯（pvc）、聚苯乙烯（ps）、聚酯（pest）和聚对苯二甲酸（pet）类等，微塑料自然降解速度缓慢，并且能够在环境中累积、迁移、扩散。

它或悬浮于水体中，或沉积到水底，广泛存在于海洋生态系统和河流湖泊等淡水生态系统，以及土壤和沉积物中，甚至在饮用水、人类粪便、极地环境中均发现了微塑料的存在。

抗生素在医疗领域挽救无数生命，用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，此外在畜牧水产行业也有广泛应用。

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2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标及内容

通过研究在微塑料影响下的大肠杆菌dh5a转化质粒表达抗生素抗性的情况，探究微塑料对抗生素抗性基因转化的影响。

主要探究纳米级微塑料和毫米级微塑料对大肠杆菌抗性基因转化的影响，通过检测ros产生量、观察细胞凋亡情况、测定细胞内外离子浓度变化情况等手段，研究微塑料促进抗性基因转化的原因。

二、关键问题
探究微塑料影响抗生素抗性基因转化的潜在机制，并且通过微塑料作用下获得转化子数量的前后比较，利用多种技术手段分析微塑料对质粒、细菌的影响进而揭示大肠杆菌转化效率改变的内在原因。

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3. 研究的方法与方案

一、研究方法
在实验室环境下，将感受态大肠杆菌DH5a接种在培养基中培养，收获后将培养物置于冰上冷却10分钟，在4摄氏度下以4000rpm离心5分钟。以冰冷的0.1M 氯化钙重悬细胞沉淀，并置于冰上20-25分钟。然后在4摄氏度下再次以4000rpm的转速离心5分钟，并使用冰冷的0.1M 氯化钙再次悬浮。将感受态大肠杆菌与质粒混合，在冷却的1.5ml试管中以0.5纳克/微升的最终质粒浓度混合。然后使用不同浓度（0、0.02、0.2、2、20、200和2000微克/升）的纳米级微塑料和毫米级微塑料加入混合物中，并在冰上温育30分钟。此后进行42摄氏度、90秒的热冲击，然后立即置于冰上5分钟。将相同体积的培养基添加到混合物中，并在37摄氏度培养3小时。接下来将20微升的混合物铺在含有100毫克/升AMP的琼脂平板上，在37摄氏度下培养48小时，以确定转化体的数量。同样，将稀释的混合物铺展到不含微塑料的琼脂平板上来检测总受体数。同时，在相同条件下设置不添加微塑料的阴性对照，以评估培养期间突变体的可能性。仅当AMP选择性平板上没有来自阴性对照的菌落生长时，才计算转化子的数量。通过将转化子数除以总受体数来计算转化频率。
此外还需测定最小抑菌浓度，以及使用流式细胞仪测定大肠杆菌的ROS和细胞通透性。
二、技术路线

见附图

三、可行性分析
在查阅了大量相关文献和论文后，目前已经具备足够的理论知识基础，能够利用现有的实验经验为本次研究提供支撑。同时，导师实验室资源能提供相关仪器和器材，能够完成本项研究。

4. 研究创新点

特色或创新之处

目前国内外对于微塑料对生态系统的影响的相关研究和微生物抗生素耐药性的相关研究比较丰富，但是对微塑料影响抗性基因转化的研究却相对比较匮乏。

本项研究旨在通过实验手段探究微塑料对微生物质粒转化的影响，丰富相关领域的研究成果。

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5. 研究计划与进展

一、研究计划

本项研究主要分为两个部分。

首先确定微塑料对抗性基因的转化有无影响，这一部分需要研究的问题包括微塑料的存在对细菌的生长究竟是促进作用还是抑制作用。

如果实验结果表明是促进细菌的生长，那么微塑料促进抗性基因转化的结果是由哪些因素主导的。

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