番茄苗期耐低温指标的筛选及耐低温材料的鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

1.1 本课题的意义

番茄（s. lycopersicon），又称西红柿、番柿，属茄科（solanaceae）番茄属植物。原产于南美洲热带地区，富含维生素c、胡萝卜素、矿物质等多种营养，果实可作蔬菜或水果，深受群众欢迎。其栽培面积较大，已成为我国主要的蔬菜种类之一。

2. 研究的基本内容和问题

2.研究的目标、内容和拟解决的关键问题

2.1 研究目标

①以不同来源的番茄品种为试材,筛选出番茄苗期较好的耐低温鉴定指标,为番茄耐低温材料筛选提供准确的测定方法。

3. 研究的方法与方案

3.研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

3.1 研究方法

本研究采用室内实验观察、理化分析测定，配合数理统计分析方法进行，主要采用蒽酮比色法分析，考马斯亮蓝法，愈创木酚法，NBT法，TBA法，碘化钾分光光度法等。通过耐低温性分组，利用相关性分析、主成分分析，聚类分析及隶属函数法分析等方法对各鉴定指标进行筛选，从而确定较好的耐低温鉴定指标。

3.2 技术路线

本研究的技术路线见下图：见附件

3.3 实验方案

3.3.1 番茄苗期耐低温鉴定指标的筛选

1、将番茄品种资源（10份材料）种子在正常条件下培养，当进入幼苗期长到6-7片真叶时，每个品种选取12株长势一致的幼苗，移到光照培养箱内进行2d预处理，即前2d内白天25℃(14h)，夜间15℃(10h)，光照度4000lx，从第3d开始白天4℃，夜间4℃，光照度4000lx（光照时数同预处理），分别处理1d，3d，5d，7d，然后取相同部位的叶片测定各项理化指标。以低温处理第0d的为对照，4℃为低温处理，重复3次。

2、冷害的分级和冷害指数的计算：0级：叶片正常，未受冷害；1 级：仅少数叶片边缘有轻度的皱缩萎蔫；2级：近半数叶片萎蔫死亡，但主茎未死，恢复常温后能长出新叶；3级：半数以上的叶片萎蔫死亡；4级：植株全部死亡。每个株系设3次重复。公式如下：冷害指数＝Σx_a /（nΣx）=（x₁a₁ x₂a₂ x_na_n）/ nT，其中，x₁、x₂、x₃x_n 表示各级冷害的番茄株数，a₁、a₂、a₃a_n 表示各冷害级数，T为调查的总株数^[17]。

3、测定不同温度处理下番茄植株中各种酶活性，酶种类包括SOD、POD、CAT。

SOD活性测定：采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法^[18]，1个酶活力单位定义为抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%所需要的酶量。3mL反应混合液中含有：1.3μM核黄素；13mM甲硫氨酸；63μMNBT；0.05M pH7.8磷酸缓冲液。加入适量酶液后在4000lx荧光下照15min，并在560nm下测定光密度。以缓冲溶液做空白，单位是U/gFW。

POD活性测定：取上清酶液40μL，利用愈创木酚氧化法^[18]测定酶活性，以每分钟在470nm处吸光度变化0.01为1个活力单位，结果以Ug-1FW表示。

CAT活性测定：参照王学奎^[18]的方法，以每分钟在240nm处吸光度变化0.01为1个活力单位，，结果以Ug-1FW表示。

4、电导率测定：采用电导法^[18]，每个品种取三株，分别取其相同部位真叶，首先用清水、蒸馏水清洗干净后晾干，再用打孔器取直径8mm的圆片10个，放在用过的青霉素小瓶中，加蒸馏水10ml，用医用注射器抽出细胞间隙中的空气，再重新缓缓放入空气，水即被压入叶肉组织中而使叶片下沉，静置20min，用DDSJ-308型电导仪进行电导率测定。然后再放入100℃沸水中水浴15min，以杀死植物组织，取出放入自来水中冷却10 min 后，测其煮沸电导率。

5、MDA含量测定：称取剪碎的叶片1g，加入2ml10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸（TCA）进一步研磨。匀浆在4000r/min，离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml（注意：对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.67%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下吸光度。按公式①可直接求得样品提取液中MDA的浓度。根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量^[18]：MDA含量(μmol/g)=MDA浓度(μmol/L)提取液总体积(ml)/植物组织鲜重(g)

①MDA浓度(μmol/L)=6.45(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56D₄₅₀ （D_532、D_600、D₄₅₀分别代表450、532和600nm波长）

6、可溶性糖测定：采用蒽酮比色法^[19]，取干净新鲜叶片3份，每份0.2g，分别放入3支试管，加入5-10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水提取30min，过滤到25ml容量瓶中，反复漂洗定容。然后取提取液0.5ml于试管中，加入1.5ml蒸馏水、0.5ml蒽酮乙酸乙酯、5ml浓硫酸，充分振荡，立即放入沸水浴中，准确保温1min，待自然冷却后，在630nm处测定其吸光度。空白对照是以蒸馏水代替提取液。

7、叶绿素含量测定：用打孔器在番茄幼苗功能叶片上打取圆片，用分光光度法测定叶绿素含量，以80％的丙酮为空白，用UV2100型分光光度计在波长663nm和646nm下测定吸光度，根据Amon方法^[20]计算叶绿素含量。

8、自由水与束缚水含量测定：采用马林契克法^[21]，每个无性系取6个烘干称重的称量瓶，分成两组，分别用于测定组织含水量和自由水含水量。在选取的叶片两侧用0.5cm²左右的打孔器各打取150个叶圆片，分别放于测定组织含水量和自由水含水量的称量瓶称重后于105℃下杀青0.5h，80℃烘干至恒重，计算组织含水量。测自由水含量的称量瓶称重后加4ml的65%的蔗糖溶液，再次称重，然后置暗处放4-6h到预定时间后，用阿贝折射仪测定糖溶液浓度和原来已知糖液浓度。然后根据下式求组织中自由水和束缚水含量(%):

自由水含量(%)= B(B1-B2)

B2*Wf*100

束缚水含量=组织水含量-自由水含量

A：样品中自由水中重量

B：加入样品中蔗糖溶液的中重量

B1：原蔗糖溶液浓度百分数

B2: 加样后糖溶液的浓度百分数

Wf: 植物样品鲜重

9、可溶性蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝染色法^[18]，取100μL酶液，加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后，在595nm处测定其吸光度。对照：全部考马斯亮蓝溶液。

10、过氧化氢(H₂O₂)含量测定：采用碘化钾分光光度法^[22]，取0.5ml酶液，加入2mlKI和0.5mlK₂SO₄，暗反应1h后，测定OD₃₉₀，对照：0.1%TCA(三氯乙酸)为参比。

11、O₂^-产生速率测定：取0.5ml酶液，加入0.5mlPBS（0.05mol/L,PH7.8）和1ml盐酸羟胺，摇匀，25℃下保温1h后再加入1ml对氨基苯磺酸和1ml1-萘胺，混合涡旋，25℃保温30min后，3000r/min，离心3min。在530nm处测定吸光度^[23]。对照：PBS代替酶液。

3.3.2 番茄材料耐低温的鉴定

对引进的番茄材料的耐低温能力进行鉴定，筛选出耐低温品种，并进一步对鉴定结果进行验证。

3.4可行性分析

本研究所选用的耐低温鉴定方法，不同研究者在不同作物中均有采用，因此研究方法是可行的。研究所在课题组从国内外引进150余份番茄材料，田间初步筛选耐低温能力差异显著，因此该研究在材料上也是可行的。加之相关性分析，主成分分析，聚类分析等方法，在小麦品种抗旱特性的综合评价^[24,25]中已有应用，因此该研究是可行的。

4. 研究创新点

4.特色或创新之处

据报道鉴定番茄耐低温指标较多，但并非所有指标与番茄耐低温都显著相关。过多相关不强指标不但增加耐低温材料选择工作量，同时也影响选择的准确性，因而需要把与耐低温相关不强的指标去除，以得到简单适用的标准。本实验利用相关性分析，主成分分析，聚类分析，隶属函数法分析等方法筛选出番茄苗期较好的耐低温鉴定指标。

5. 研究计划与进展

5.研究计划及预期进展

（1）2012年5月-6月 查阅相关文献，确定试验方案和技术路线；

（2）2012年7月-8月 搜集实验资料，准备实验材料以及实验需要的各种化学药品等；