利用SRAP分子标记技术鉴别梨的芽变品种开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

梨为蔷薇科(rosaceae)，梨属植物，世界梨属植物约有60余种，分布于欧、亚、北美洲及南半球温带地区。我国目前梨属有18个种，其中原产我国的有13个种[1]，而且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[2]，其栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果，位居第三位，具有重要的经济价值。因此作为一种非常有经济价值的植物，对其种质资源的研究有着非常重要的意义。

与传统杂交育种方式相比，芽变育种可以避开童期等因素的干扰，可在基本保持原有品种综合性状同时针对个别缺点进行改良，能大大简化育种程序，显著缩短育种时间，节省大量人力、物力和土地；此外新的芽变品种还可以不断丰富原有的种质资源库，给杂交育种提供新的选择亲本。我国梨芽变选育工作在育种家和生产者的长期重视下，经多年积累已取得了显著成绩。

芽变是体细胞突变的一种即芽分生组织细胞发生的遗传物质突变，梨的芽变主要分为大果型芽变、皮色芽变、成熟期芽变、耐贮性芽变、杂交亲和性变异。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

以9组梨（包括梨原种及其芽变品种共19个）为研究对象，通过srap分子标记的dna水平遗传多样性分析，以鉴别原种梨及其芽变品种。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

（1）试验材料为本实验室收集和到南京农业大学江浦农场采集的梨19个品种。

（2）采用CTAB法提取各品种资源的基因组DNA。具体方法参照VanVL,1998年的文献(VerdoodtL,VanHanteA,GoderisIJ,etal.useofmulti-allelicself-incompatibilitygeneinappletoassesshomozygocityinschoolsobtainedthroughhaploidinduction[J].TheorApplGenet,1998,96:294-300)。

（3）对PCR体系中各影响因子进行优化，包括模板浓度、引物浓度、dNTP、Mg2 浓度、酶的用量、退火温度、反应循环数等，建立稳定、高效的标记技术体系。

（4）利用建立的优化体系，选择多态性好、扩增稳定的引物对所有品种资源进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行差异性分析。

2.技术路线

①　19个梨样品DNA的提取

②　利用一组DNA（梨及其芽变梨）从19对引物中筛选合适的引物

③　利用筛选出的SRAP引物在19个梨样品上进行PCR扩增

④　1.0%琼脂糖凝胶电泳检测

⑤　扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑥　扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑦　条带统计并对每组进行差异性分析

⑧　分析各种SRAP引物鉴别芽变的效率

3.实验方案

（1）样品叶片的采集和保存

采集幼嫩的叶片，置自封口塑料袋中，用手轻压排去袋内的空气，封口，写上名称，置于放有冰袋的泡沫盒中，回到实验室清洗叶片后液氮处理，并置于-70℃冰箱中保存备用。

（2）提取DNA

①　称取1.0g幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，加入1ml65℃预热的CTAB溶液和20l2%的巯基乙醇，快速转入2.0ml离心管中，补齐2.0mlCTAB溶液。

②　将装有CTAB和样品的离心管放入65℃水浴，每5min轻轻震荡几次，45min后12000r/min，20℃，离心15min。

③　小心吸取上清液，装入一新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），摇床10min，12000rpm，4℃，离心10min。

④　小心吸取上清液，装入一新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），摇床10min，12000rpm，4℃，离心10min。

⑤　小心吸取上清液，装入一新的离心管中，加入上清液1/10体积的NaAc（3mol/L）和1ml-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中静置沉淀30min。

⑥　12000rpm，离心10min，弃上清。

⑦　向离心管中加入75%的乙醇洗涤2-3次，置于通风厨中晾干。

⑧　加入ddH2O（10-20l）溶解，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将DNA稀释至所需浓度25ng/l，于-20℃或者-70℃下保存备用。

（2）用琼脂糖凝胶电泳检测原液DNA，再根据检测结果稀释DNA

琼脂糖凝胶电泳:

①　制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml)：称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中，加入70ml(50ml)1TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

②　胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。将内槽置于水平位置，先用少量的琼脂糖凝胶液封底，再将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入EB，混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，然后在固定位置插好梳子。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下玻璃板，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。

③　点样：在点样板混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1。用10l微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面(注意：加样前要先记下加样的顺序)。

④　电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

⑤　电泳完毕后，取出凝胶。

⑥　观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

（3）SRAP引物筛选

利用SRAP-PCR反应体系，从19对合成的SRAP引物组合中筛选出能产生清晰扩增产物、多态性较好的引物组合。

合成的SRAP标记正、反向引物序列

ForwardandreverseprimerssequencessedinSRAPanalysis

（4）PCR扩增

利用筛选出的SRAP引物对19个梨品种资源用SRAP-PCR反应体系进行DNA片段扩增。SRAP-PCR扩增采用复性变温法，共40个循环，即94℃预变性5min；前5个循环:94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1.5min；后35个循环：94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延1.5min；循环结束后72℃延伸7min，-4℃保存。

（5）扩增产物检测

先取4lPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,若与预期片段大小相近且条带清晰,再通过8.0%的变性聚丙烯酞胺凝胶(PAGE)分离,银染后观察，拍照。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①　凝胶的制备：将两块玻璃板（其中一块两端有耳）在两端通过长条板（宽度小于有耳玻璃板耳的宽度）涂抹凡士林黏在一起，放在长槽中并固定在制胶架上。

②　封底：0.8g琼脂糖 80mlTBE（1），在微波炉中加热溶解，稍冷却后，在长槽中倒入适量的琼脂糖溶液，封住底部。

③　凝胶溶液的配置：四块板的用量，按下面的顺序依次加入烧杯中，搅拌均匀。

④　倒胶、插梳：待底部凝固后，倒入凝胶溶液，马上插入梳子，然后再用枪头补好凝胶，并及时加入适量凝胶，确保凝胶完好。

⑤　凝胶凝固后，拆下并重新固定在电泳槽上，电泳槽两边固定好后，倒入足量电解液（1TBE）,然后拔掉梳子，同时用针把歪的孔摆平。

⑥　点样：在每个PCR产物中加入2.5l溴酚蓝，然后再凝胶的各个孔中加入1.5lMark2000和PCR产物，每块胶上点3个Mark（第一个和最后一个，另一个确定第几块）。

⑦　跑胶：两块胶点好后，接电，180-190V、100W跑2-3h到槽子下面第一条线。

⑧　银染：将凝胶取下后，先用蒸馏水洗2min，然后在摇床上用银染液银染15-20min。　

⑨ 显色：银染完成后，先用蒸馏水洗，然后在摇床上用显色液染色，直至出现清晰条带。

4.可行性分析

本研究思路是所在课题组多年来一直从事果树分子遗传方面研究的基础上形成的。试验研究将在本实验室开展，试验材料由南京农业大学园艺学院试验基地提供。试验过程将在南京本地进行，本研究多数为室内试验，不受季节等因素的影响，可利用课余时间，暑假期间进行试验分析，避免与学习时间冲突。曾利用课余时间在实验室做一些基础试验研究，具有较高的试验操作水平，另外还具备较强的问题分析能力，并开展了部分预备试验，完成了基因组DNA的提取工作，试验结果良好。

指导老师吴俊教授所在实验室为果树分子生物学实验室，在多年的研究积累中，收集了大量果树资源，并且承担了国家863项目的果树分子育种计划研究，在目前的研究中获得良好结果，并且发表了相关论文，具有良好的研究基础。所在实验设备齐全，研究条件良好，这些均为本项目的顺利完成提供了技术和人力的保障。

4. 研究创新点

（1）利用SRAP鉴定芽变品种的实验不多。

（2）在果树研究中，芽变品种的高效鉴定存在一定的空白，本试验筛选出一些高效引物，来鉴别芽变品种。

5. 研究计划与进展

2013.4-2013.6确定详细实验方案，准备实验所需试剂，并通过预备实验掌握各项试验技术。

2013.7-2013.8建立稳定、高效的pcr技术体系，利用多态srap性引物对19个梨种质资源进行扩增并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2013.9总结试验结果，论文的撰写并提交课题总结。