翦股颖草坪草在高温与干旱胁迫下抗氧化代谢的变化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

草坪是城市园林景观中很重要的组成部分，随着社会经济发展和文化生活水平的提高，人均占有绿地面积与住房面积一样，在全球呈现稳定增长的走势。草坪绿地的多少，已经成为衡量现代化城市环境质量和文明程度的重要标志之一（任继周，2000）。

匍匐翦股颖(agrostis stolonifera l.)为禾本科翦股颖属多年生草本植物,俗名本特草，四季青，是一种冷季型草坪草。原产于北美和欧亚大陆的温带，我国东北、华北、西北及江西、浙江等地均有分布。翦股颖在气候过渡区具有绿期长、矮生、叶细、株密的优异特性，质量超过其他任何冷季型草坪草，且质地细软、恢复能力强，耐频繁低剪，应成为最具应用潜力的种质资源之一。近年来我国各地在高等级城市绿地、居家庭院、屋顶花园、高尔夫球场和运动场草坪建植中倍受关注。在我国气候过渡地区，夏季高温，并伴随降水的减少，使高温和干旱双重胁迫成为制约草坪草生长的主要因素。逆境胁迫对草坪草造成的伤害主要体现在草坪坪观质量下降；叶片相对含水量下降，出现叶片萎蔫甚至干枯；叶绿素分解速度加快，叶色逐步呈现枯黄；叶片细胞膜稳定性遭到破坏；叶片中短时间内出现大量丙二醛积累等，而生理结构上的损伤多由于植株体内氧化物质积累造成。在多重胁迫环境下，高温胁迫加剧干旱胁迫，植物失水速度提高，叶片枯黄面积增大，草坪质量迅速降低，植株短时间内会出现大面积死亡。目前已有一些关于高温干旱双重胁迫的报道，万里强等选取多年生黑麦草作为试验材料，观察了叶绿体和线粒体超微结构的变化，结果显示，抗热抗旱性较强的品种叶绿体受损程度较轻。刘晓军等以苇状羊茅为材料，研究了高温干旱胁迫下，苇状羊茅对不同水肥条件的响应机理。而有关双重胁迫对草坪草抗氧化系统影响的报道较少。草坪草生长在多变的环境中，往往会同时或相继遭受不同逆境的影响，在长期适应中形成应对不同逆境的策略。本研究利用人工气候箱模拟干旱与高温环境，观察和比较了在不同胁迫下，冷季型草坪草匍匐翦股颖抗氧化酶代谢的变化规律，揭示冷季型草坪草应对温度升高和水分亏缺的生理生化机理，为培育抗热抗旱型草坪草新品种提供理论依据。

前人对草坪草的研究已取得了重大进展，他们不仅从生态学角度研究了草坪草对高温、干旱的适应，而且还掌握了草坪草在干旱胁迫或高温胁迫时的一些生理生化指标的变化规律，并初步探讨了草坪植物在高温及水分胁迫时的生理生化机理，以期弄清草坪植物对高温及水分胁迫的生理生化机制。但从目前来看，由于我国的草坪科学研究起步晚，始于20世纪60年代初，主要涉及的是栽培管理、引种实验，病虫害的防治和铺植技术，从生理生化机理方面来研究草坪草的抗逆性才刚刚起步，多数研究只限于草坪草的田间观察比较或室内控制下用某一两个生理生化指标来对草坪植物的抗逆性作比较。国外草坪科学的研究始于1885年，由于科技的进步，国际上一些草坪绿化先进的国家对草坪草的研究已经从传统的栽培管理和种质资源的开发利用逐步转向利用先代先进技术培育新品种和新品系，并从植物生态学、植物生理学和生物化学及分子生物学方面进行了深入的研究，如利用组织培养和细胞杂交技术导入外源良种草坪草基因，研究在各种逆境条件下草坪草的一些特征，并找出生理生化机制和遗传机理，进而找出其抗逆性基因。

2. 研究的基本内容和问题

研究内容

（1）翦股颖草坪草在高温与干旱胁迫下抗氧化代谢的变化，指标主要包括叶片相对含水量、叶片膜透性、丙二醛（mda）、抗氧化物酶（超氧化物歧化酶（sod）、过氧化物酶（pod）、过氧化氢酶（cat）和抗坏血酸过氧化物酶（apx））。

（2）描绘出不同条件下各项指标的的变化趋势图，探明翦股颖草坪草抗热机制以及抗旱机制以及双重抗性机制。

3. 研究的方法与方案

研究方案：

（1）翦股颖草坪草（L-93）的栽培养护

材料前期的培养，即材料的质量对后期的实验影响颇大，比如对测量数据的影响，草的生命终结速度不能太快而影响了取样的次数。

（2）抗氧化代谢变化研究

通过研究翦股颖在高温胁迫、高热胁迫以及高温和高热双重胁迫的条件下，叶片相对含水量、叶片膜透性、丙二醛（MDA）、抗氧化物酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX））的变化。 （3）抗性机制的探讨

对不同条件下的各项抗氧化代谢指标作出变化趋势图，通过比较分析，查阅资料，探明抗性机制。

实验的方法：

1、试验材料的准备：选取常见冷季型草坪草匍匐翦股颖L-93。材料培养初期，采用5 g /㎡的种植密度将种子播撒在容器中；种子萌发3个月后移入温室内进行扩繁生长。9个月过后，选取生长状况一致，长势良好的植株作为试验材料，移入高20 cm，直径15 cm的塑料盆中进行实验。

2、试验处理：试验采取随机区组设计，处理分为对照处理、高温处理、干旱处理以及双重胁迫处理。每个处理设置四盆重复，每盆移入20棵L-93植株。材料提前一周放入人工气候箱内进行适应性生长，箱内控制湿度50 %，光照12000lux。具体处理方法：

对照处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h /12 h，每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。

高温处理，昼温35 ℃/夜温25 ℃，光周期12 h /12 h。每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。

干旱处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h /12 h。自然干旱，不进行任何形式的补水。

双重逆境处理，昼温35 ℃/夜温25℃，光周期12 h /12 h，，试验期间不进行任何形式的补水。

3、相应指标的测定：在人工气候箱内培养一周后，开始取样测定，每隔5天取一次，共进行5次重复性试验。

3.1 叶片相对含水量

剪取新鲜叶片0.2 g，w_f；将取得的叶片组织浸泡于去离子水中24h，取出用吸水纸擦干表面水分，称取其饱和重w_t；随后将叶片转移至80℃烘箱内烘24h，冷却至室温后称取其干重，w_d。

相对含水量=（w_fw_d）/（w_tw_d）*100%

3.2 叶片膜透性

采取相对电导率法，将叶片浸泡于装有去离子水的50 ml离心管中，震荡24小时后测定电导率值，E₀；随后将离心管放入水浴中，煮沸后测定电导率值，E_b。

相对电导率= E₀ /E_b *100 %

3.3 丙二醛（MDA）

丙二醛（MDA）含量测定，采用李合生的巴比妥酸（TBA）显色法测定。

3.4抗氧化物酶

取叶片0.5 g，加入液氮研磨成粉末状后溶解于4 ml磷酸缓冲液（pH 7.8,0.05 mol/L），在4℃、12000 r/min下离心20 min，得到的上清液放入4℃条件下保存，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性。

SOD活性采取氮蓝四唑（NBT）还原法测定：取50 μL酶液，加入混合反应液含0.05 mol/L磷酸缓冲液、0.13 mol/L Met溶液、750 μmol /LNBT溶液、100μmol /LEDTA-Na₂溶液、20 μmol/L核黄素溶液，以不加酶液作为对照，测定560 nm处的吸光值。

POD活性通过愈创木酚法测定：取40μL酶液，加入反应液含50 ml 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液、28μL愈创木酚、19μL 30% H₂O₂溶液，以磷酸缓冲液作对照，测量470 nm处的吸光值。

CAT活性的测定：取0.1mL酶液，加入2.9 mL反应液，以磷酸缓冲液作对照，测定1 min内240nm处吸光值的变化。反应液中含有100 mL 0.05mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液、0.1546ml30% H₂O₂溶液。

APX活性的测定：取0.1 mL酶液，加入2.6mL含0.1 mmol/L EDTA-Na₂的磷酸缓冲液（0.05 mol/L ,pH7.0）、0.15 mL 15 mmol/L的抗坏血酸溶液、0.1mL 20 mmol/L的H₂O₂溶液，测量290nm处吸光值在1 min 内的变化^[10]。

试验测定使用的紫外分光光度计为美国通用GE Ultrospec 9000型。

4、试验数据的处理：采用SPSS 13.0进行数据处理与分析，LSD法检验差异显著性（p0.05）。

5、根据数据，探明草坪草抗性机制。

技术路线

4. 研究创新点

（1）研究思路有创新：不仅从形态学角度对耐热翦股颖坪用特性进行系统评价，还对抗性翦股颖细胞特异质进行系统研究，揭示翦股颖的抗性机制机理。

（2）研究方法有创新：将细胞生物学技术引入抗性翦股颖种质发掘过程中，探明不同翦股颖品种的亲缘关系，为抗性翦股颖新品种的选育提供理论依据。

（3）研究成果具有广泛的应用前景：筛选出的抗性强、绿色期长、品质好的翦股颖新品种，可满足夏季高温伏旱地区对优质草坪草的需求。

5. 研究计划与进展

年度研究计划

2012年9月--2012年12月：翦股颖草坪草（l-93）的撒播与管理。

2012年12月--2013年9月：移入温室内进行扩繁生长。