增强型35S启动子在菊花遗传转化中的应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义

菊花(chrysanthemum morifolium )是中国十大名花之一，原产于我国，属于菊科菊属宿根性多年生草本花卉^[1],是经长期人工选择培育出的名贵观赏花卉，又称艺菊、鲍菊，在我国已有3000多年的栽培历史；同时它也是世界四大切花之一，占全球切花数量的30%，是世界上消费量最大的切花之一，并且其周年市场需求稳步攀升。^[2]菊花的品种繁多,花期长、色泽艳丽、花形各异，既可孤植单摆，又可群体组摆，观赏价值高，近年来在绿化美化中的作用越来越大，深受群众的喜爱，是一种大众消费型花卉。随着我国经济的发展和人民生活水平的提高, 切花菊在切花消费中占有很大的比重, 其栽培面积居我国切花生产的首位。全世界菊花品种达7000多个，我国的菊花品种也多达3000多个，由于花卉市场的发展和人们观赏水平的变化，对菊花品种的需求也呈现多样化，要求人们不断培育新的品种，而育种技术在新品种的选育中起着至关重要的作用^[3]。但由于菊花的遗传背景十分复杂，基因型高度杂合，基因库缺少蓝色基因、早花期基因等某些特性基因，限制了其常规育种的进程；人们逐渐把目光转向了具有定向育种优势的基因工程育种，通过外源基因的人工导入，定向修饰菊花的某个或某些目标性状并保留原有的优异性状，从而获得具有目标性状的菊花新材料，为植物种质资源的创新，包括菊花育种提供了一条新的途径^[4]。

自从1983 年首例转基因植株问世以来，一大批具有重要农艺性状的基因通过基因枪或农杆菌介导法转入植物得到表达，转基因技术也成为进行作物品种改良和基因功能研究的重要手段^[5]。1989年发现了菊花对农杆菌浸染的敏感性，并因此在菊花上开发了遗传转化技术^[6]。在众多花卉的研究中，菊花是基因工程起步较晚的观赏植物，转化过程受菌株类型、基因型等的影响，成功转化并能稳定表达的研究报道很少。随着对转基因植物的深入研究发现：大量外源基因并没有得到预期表达，不同转基因个体中外源基因的表达也存在较大差异。

外源基因的表达调控比较复杂，不仅受到不同强度启动子的调控，而且转录水平的抑制和转录后mRNA积累的抑制也会造成基因不同程度地沉默^[7]。启动子是调控基因转录的一段DNA序列，可供RNA定位，通常位于基因的上游区域，其长度一般不超过200bp；同时也是基因转录调控机制和表达模式中最关键的因子。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控机制和表达模式, 并有效地应用于基因工程中提高或改进外源基因的表达^[8]。

为了便于基因工程学的研究，把植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能分为三类：组成型启动子(constitutive promoter )、诱导型启动子(inducible promoter) 和组织特异性启动子(tissue-specific promoter)。这种分类大体上反映了它们各自的特点, 但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。

植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子，按来源可分为外源组成型启动子和内源组成型启动子。组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的，在植物中一般控制结构基因的表达，包括异源和内源组成型启动子两类。在该类型启动子控制下，基因的表达在不同组织部位表达水平也没有明显差异，为此称之为非特异性表达组成型启动子，其特点是:表达具持续性，RNA和蛋白质表达量也是相对恒定，它们不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导^[9]。植物基因工程中应用的异源组成型启动子主要有CaMV35S启动子。CaMV35S启动子，能在大部分植物中对异源基因进行启动表达，完整的CaMV35S启动子是植物基因工程中应用最为广泛的以表达为目的的组成型启动子之一。由于CaMV35S在双子叶植物中表达效率较高^[10]，在双子叶植物的遗传转化中经常使用，如在马铃薯、拟南芥、烟草、蘑菇、毛白杨、等植物中的转基因应用^[11]。CaMV35S启动子是来源于烟草花叶病毒基因的启动子，是一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中，对它进行改造的许多启动子可以有效提高外源基因的表达水平。同时对该启动子的一些元件进行串联，也可以有效提高外源基因的表达水平。在菊花的转基因中，常用的组成型启动子也为CaMV35S启动子，大部分的菊花转基因中用到的启动子都为CaMV35S启动子^[12]。

2.国内外研究概况

菊花的基因工程起步较晚，早期的研究主要是建立有效的菊花再生体系和探讨遗传转化中的各种因素对转化的影响，转入的基因主要是NPTⅡ^[13]和GUS^[14]报告基因。后期则以转入目的基因为主，旨在通过对菊花定向改良性状的研究，拓展菊花新品种^[15]。植物转基因中外源基因的表达调控比较复杂，其中启动子不同是导致外源基因表达水平不同的因素之一。用于菊花分子育种中不同转化载体的不同启动子，在不同的菊花品种中的表达效果有所区别^[15]。详见表1。

启动子	来源	供试品种	GUS活性	功能
CaMV35S Lhca3.StL UEP1 rbcS1 cab EF1α rd29A	花椰菜花叶病毒 马铃薯 菊花 菊花 菊花 烟草 拟南芥	地被菊等 cv.1581 cv.1581 cv.1581 Sei－Marine Cherry等 Fall Color	未报道 25000/140000 900／1400 17 000/70 000 1100／27 000 16000／29 000 未报道	增强表达 编码载体蛋白2 内源性泛素化蛋白 导致β－葡萄糖醛酸酶积累 叶绿素Ⅱ型a／b 结合蛋白 延伸因子1α 逆境胁迫下表达

由于CaMV35S在双子叶植物中表达效率较高，在双子叶植物的转基因中普遍使用。焦改丽等^[16]在研究CaMV35S启动子在转基因棉花中的表达中发现，该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都有表达，且随着胚胎发育进程被逐渐调节。郝林等^[17]研究表明CaMV35S双启动子能显著提高转基因在拟南芥中的表达水平。洪波等^[18-19]将CaMV35S或rd29A驱动的干旱转录因子AtDREB1A导入地被菊花品种Fall Col-or，利用胁迫诱导型启动子，很好地开展了菊花抗非生物胁迫方面分子育种的研究。邵寒霜等以野生拟南芥(Arabidopsisthaliana)为材料,克隆并测序了Leafy(LFY)基因的全长cDNA；同时构建了LFYcDNA以CaMV35S为启动子的植物表达载体，并转化菊花，获得花期提前或延迟的菊花新品种^[20]。

3.应用前景

通过常规的杂交育种手段，菊花的品种改良已在株形、花色、花期、抵抗病虫害和非生物胁迫等方面取得了显著的成绩。但菊花高度杂合的特点使其在杂交育种中不确定性很强，生殖或地理隔离使其无法充分利用近缘种属植物的优良基因资源，常规方法育种存在较大的局限性。转基因育种目前已成为菊花新品种培育的重要手段，外源基因的导入有针对性地改善了目标性状并保留原有优良性状，实现了利用新基因资源改良菊花品种的目标^[21]。目前，利用分子育种培育菊花新品种，改善菊花生产上病虫害严重、花期集中的状况已经成为可能，但相对于研究较成熟的拟南芥、烟草等植物而言， 应用于菊花基因工程研究的外源基因还较少，如在抗病毒研究中导入的外源基因只有TSwV一类，移动蛋白基因MP、干扰素基因等一些广泛被用于抗病毒基因工程的基因还未见在菊花遗传转化方面的报道^[15]。此外通过各种转化手段成功导入到宿主的外源基因往往表达效果不理想，难以实现预期的目的；而且在不同植株个体之间表达水平也存在着明显的差异[22]。外源基因的表达调控比较复杂，受到不同强度启动子的调控。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控机制和表达模式, 并有效地应用于基因工程中提高或改进外源基因的表达^[8]。基因表达调控的分子机制是基因工程原理的指导思想，近年来，对于菊花基因工程中常用启动子的研究有所发展。随着分子生物学及基因工程技术的不断成熟和飞速发展，菊花分子育种的进程将更加迅速，并有可能为菊花产业发展做出极大的贡献。

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2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标

本实验通过对增强子35s在菊花遗传转化中的应用的研究，了解菊花基因工程育种发展现状及基因工程育种和传统常规育种方式相比较所占的优势；掌握由农杆菌介导的菊花遗传转化实验的基本研究方法，探索菊花分子育种过程中启动子对外源基因表达效率的影响效果。拟证明camv35s在菊花的遗传转化过程中能提高外源基因的表达效率，使导入的外源基因在转基因后代中显著表达；提高菊花遗传转化的成功率，为菊花分子育种的广泛应用奠定基础，为菊花种质资源的创新提供更有效地途径，能更有效得满足市场对菊花品种多样性的需求。

3. 研究的方法与方案

1.实验方案

1.1载体构建

阅读与camv35s启动子在转基因中的应用相关的文章，通过启动子克隆技术克隆出适量camv35s启动子的序列，再与gus报告基因相连，选择可用的载体导入该片段，进行载体构建。

4. 研究创新点

外源基因的表达调控比较复杂，受到不同强度启动子的调控。对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控机制和表达模式, 并有效地应用于基因工程中提高或改进外源基因的表达。

目前，利用分子育种培育菊花新品种，改善菊花生产上病虫害严重、花期集中的状况已经成为可能，但相对于研究较成熟的拟南芥、烟草等植物而言，应用于菊花基因工程研究的外源基因还较少。

5. 研究计划与进展

2013年9月: 进行载体的构建：农杆菌和重组质粒过夜摇，构建载体。

2013年9月-10月：侵染菊花叶片。

2013年11月：对转基因叶片进行gus分析。