水稻OsATG8a基因参与水稻氮素利用的可能性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.1研究背景及意义

水稻是我国重要的粮食作物之一，其播种面积和总产量均为粮食作物首位。我国有一半以上人口以稻米为主食，它是我国居民饮食中热量和各种营养元素的主要来源^[1]。与此同时，水稻也是世界主要的粮食作物。世界水稻的种植面积达15亿公顷，占总耕地的10％，主要在亚洲地区。近年来，随着世界人口的不断增长(且主要发生在以水稻为主食的世界不发达地区)和耕地面积的日益减少，至2025年，水稻产量要在目前的基础上增加50、60％方能满足增长的人口对粮食的需求^[2]。我国一直将提高水稻单位面积产量作为水稻生产的主要任务。随着农业和化肥工业的发展，作物施氮量迅速增长，但水稻氮素利用效率随着氮肥用量的增长明显下降。过量施用氮肥直接后果是氮素的利用效率的降低，能源的巨大浪费，更造成严重的环境污染。随着农业资源利用与环境保护矛盾的日益加剧，人们越来越重视研究及改良水稻氮素利用的遗传潜力，从根本上提高水稻对土壤和肥料氮的利用率^[3-6]。充分挖掘作物吸收利用氮素的遗传潜力，从而在一定的氮肥投入下获得较高的产量，并减少氮素在土壤中的残留，是提高氮肥利用率的重要途径之一。而遗传改良的先决条件是了解控制作物高效吸收利用氮素的关键生理过程。因此，在现在高产品种选育过程中，氮素利用效率的基因改良具有重要的理论和现实意义。

1.2研究概况

2. 研究的基本内容和问题

研究内容

（1）osatg8a基因在水稻的表达情况：表达部位，表达时间，表达强度。

（2）不同氮浓度对其表达情况的影响，筛选出对氮浓度变化敏感的基因以进一步试验。

3. 研究的方法与方案

研究方法和试验方案

(1)试验材料

以水稻粳稻（OryzaSativaL.ssp.japonica[13]）品种日本晴为研究材料。PCR反应获得目的基因片段，连入pCAMBIA1301[14]载体，测序结果正确后，将目的基因片段酶切切下连入表达载体，转化大肠杆菌，提取质粒后验证正确，电转化入农杆菌，制备农杆菌侵染工程菌液，侵染水稻愈伤，进行组培实验获得转基因材料。

(2)试验设计

1．消毒：

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：

1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；

2）倒去酒精，加入100ml3%次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；

3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。

2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）

1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；

2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；

3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)

4）水稻苗期水培营养液配方：

3.试验处理：

种子发芽后，清水培3-6天，1/8培养1周后进行氮磷处理。设定4个处理，正常氮磷处理（2.5mMN和0.3mMP）；低氮处理（0.2mMN）;低磷处理（0.01mMP);低氮低磷处理（0.2mMN和0.01mMP）；

4．统计数据：

1）在氮磷处理1周后观察根系长成，通过扫描，统计数据；

5．在氮磷处理1周和2周时分别采样进行分析基因表达，通过测磷测氮，分析氮素吸收效率，转运效率，利用效率，生物量和产量，优化生物途径提高氮素利用效率。

4. 研究创新点

特色或创新之处

以水稻粳稻（Oryza Sativa L. ssp. japonica）品种日本晴为研究材料。，研究其在不同浓度以及其他条件胁迫下的生长、生理特征的变化，比较其氮素吸收效率，转运效率，利用效率，生物量和产量，来优化生物途径提高氮素利用效率。这一研究具有鲜明的特色和创新性。

5. 研究计划与进展

试验进度安排

2014年2月至2014年3月

查阅课题相关文献，学习实验室各种仪器设备的使用，掌握分子实验基本操作方法，学习组培实验方法；对目的基因进行转基因操作，获得转基因株系，初步鉴定过量表达效果较好的转基因材料；