生物法制备燃料乙醇研究及其现状调研开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：

随着世界化石能源的日益匮乏和人类对能源需求的不断增加，以及传统化石能源的环境污染，可再生清洁能源的开发日益引起人们的广泛关注。生物质燃料作为一种清洁能源具有无污染和可再生性，有望替代化石燃料，有效解决能源危机。

生物乙醇作为一种可再生的清洁能源，在2000年开始受到了国家的重视和推广。当时的第一代生物乙醇以糖和淀粉作为原料进行生产，主要原料为粮食作物，容易造成粮食危机。第二代燃料乙醇生产则是以木质纤维和非粮类淀粉物质为原料生产燃料乙醇，其主要代表原料有农作物废弃秸秆、木薯等。由于原料来源广泛、价格低廉且不与人争粮，第二代生物乙醇生产技术已经成为当今主要的生物乙醇生产方式。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

研究同步糖化和分步糖化发酵制取燃料乙醇的最佳反应条件，研究漆酶与纤维素酶的协同作用。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

技术路线：(可见附件)

图1 技术路线

研究方法与实验方案： 调查广西、广东地区生物制生物乙醇的市场情况及部分工厂的生产方式。根据文献选择出对生物乙醇发酵影响较大的三个因素进行正交实验。并同时研究漆酶与纤维素酶在生物乙醇制取过程中的协同酶解。

实验方案细化：

一、 通过气相色谱仪准备以乙醇与异戊醇峰值面积比为Y轴的乙醇气相标准曲线（可见附件）

图2 乙醇气相标准曲线

二、使用分光光度计准备以葡萄糖含量为Y轴的OD值标准曲线

总糖含量的测定测定方法选取DNS法，测量前用标准葡萄糖液制作葡萄糖标准曲线。如下图（可见附件）

图3 还原糖含量标准曲线

还原糖测量：取样，离心，取0.5 ml糖液，置于25 ml刻度试管，再加1.5 ml DNS试剂，沸水浴5 min，取出迅速冷却，用去离子水定容至20 ml。摇匀，用分光光度计在520 nm下测OD值。带入标准曲线获得还原糖含量。

三、单因素实验

首先进行秸秆不同颗粒度的单因素实验，使用40目、10目、4目的滤网分别筛选出0.375 mm、1.75 mm、4.75 mm尺寸大小的秸秆颗粒。分别取3种秸秆颗粒各3 g加入250 ml的三角瓶中，按照颗粒溶液1 g:20 ml的比例加入60 ml HAC-NaAC缓冲液，充分摇匀2小时后按照3000 U/g的纤维素酶加入量加入酶液，放入37度摇床中进行反应，每隔12小时进行取样检测溶液中葡萄糖含量情况。

同理准备进行不同纤维素酶加入量和不同原料反应液比例进行单因素实验。

四、正交实验

根据正交软件设计出正交实验方案，如下表

五、同步糖化与分步糖化

（1）分步糖化

按照正交设计进行9组实验。每组取3 g秸秆加入纤维素酶及缓冲液进行糖化，48 h后，取得上清液后将9组上清液进行煮沸过滤离心(12000 r/min 10 min)，确保溶液中的蛋白质已全部去除，方便进行灭菌后的溶液接种。（灭菌条件为115 ℃、15 min）

配置糖化发酵培养基，每份培养基含有蛋白胨0.5 g、KH₂PO₄ 1 g、MgSO₄7H₂O 0.3 g、NH₄Cl 2.0 g、PH=4.8的柠檬酸钠缓冲液100 ml。取灭菌过的上清液作为发酵碳源，加入到灭菌后的培养基中并接种酵母进行乙醇发酵，酵母的接种量为每瓶0.2 g。37度摇床培养48 h，每12 h取样检测乙醇含量。

（2）同步糖化

按照正交设计进行9组实验，在每组三角瓶中加入3 g的秸秆。以糖化发酵培养基作为缓冲液灭菌后按照9组实验的固液比加入到各三角瓶中，加入纤维素酶后进行酵母的接种，酵母的接种量为每瓶0.2 g。37度摇床培养48 h，每12 h取样检测乙醇含量。

六、漆酶与纤维素的协同酶解

（1）漆酶添加对纤维素酶解的影响

按照分步糖化得出的结果，取秸秆和缓冲液按照最佳固液比放入三角瓶中，添加漆酶后置于45 ℃条件下处理48 h后添加纤维素酶进行酶解，每12 h取样测定还原糖的含量。

（2）漆酶与纤维素酶协同酶解作用按照分步糖化得出的结果进行实验，同时添加漆酶和纤维素酶后置于45 ℃条件下处理48 h，每12 h取样测定还原糖的含量。

（3）漆酶与纤维素酶协同酶解作用对酒精发酵的影响按照同步糖化的最优条件准备材料后放置于三角瓶中，添加漆酶后置于37 ℃的条件下培养48 h，其中每12 h取样测定乙醇的含量。

4. 研究创新点

创新之处：

前往广东广西地区进行了调查工作，了解到目前生物乙醇生产及市场情况。根据影响最大的因素设计准备正交实验。在对原料预处理上，选择生物预处理的方式，采用灵芝发酵废弃的漆酶液对原料进行漆酶与纤维素酶的协同酶解，探究对灵芝发酵废液的二次利用。

5. 研究计划与进展

计划：

2014.09-2014.12

广东广西地区生物乙醇使用情况的调查，了解生物乙醇在当地的使用情况，以及广西、广东地区的生物乙醇市场价格情况。