乙烯对荷花响应镉胁迫的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况（列出主要参考文献）

重金属镉（cd）是一种优良的金属，广泛应用于颜料、电镀金属、合金制备、塑料的稳定剂和农业植物病虫害的防治上面^[1]。但cd并非生物体必须营养元素，大量积累会对生物体造成毒害作用。cd 主要是以与蛋白质结合的方式干扰植物中各种酶的功能，以此来对植物的各项生理生化功能造成伤害^[2]。近年来我国水体cd污染现状日益严重，自然环境中的cd在一定的环境及生物因素互作下可进入到食物链中，并最终威胁到人类的健康和安全^[3]。

正因如此，探索合适的方式清除自然界水体中的重金属已经受到人们的极大的重视。植物修复以其经济、高效而且便于修复后回收处理，防止含有重金属的植物残害滞留土地，造成二次污染等优势逐渐被人们所推崇^[4]。研究表明芦苇可用于 cd、cr、cu、hg、mn、ni、pb、zn的水体和底泥中重金属的修复^[5]；菹草具有富集cu、cd、pb、zn四种重金属的能力^[6]；田俊杰^[1]在对凤眼莲和紫玉簪进行重金属 cd 富集的比较中表明凤眼莲和紫玉簪都有重金属清除能力，且凤眼莲比紫玉簪对 cd 的富集能力更强。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1研究目标

以微山湖红莲为试验材料，分析cd单独处理、cd和acc复合处理、cd和sts复合处理下乙烯是否参与及如何调控荷花对重金属cd的响应。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1研究方法

1.荷花幼苗的培养：

用枝剪对红荷种子进行破壳，用去离子水培育1周后换用5％的霍格兰培养液培养两周，待荷花幼苗展叶后进行试验。

2.实验方法：

2.1电导率测定方法

测定方法参照孙守家(2003)的方法，略加改动。

取各处理相同、长势一致的叶片和茎干，用去离子水冲洗干净并用滤纸吸干外附水分，各取0.2g于大试管底部，加入 5ml 的蒸馏水，并使之完全浸入水中。在室温下震荡24h后，充分摇匀用电导仪测定电导值 E₁，沸水浴中加热 30min 后，冷却至室温测定电导值 E₂，根据公式计算出相对电导率(L)。

相对电导率（L）= E₁/ E₂100％

2.2丙二醛(MDA)含量的测定

将待测叶片擦拭干净，剪碎。称取 0.2g 叶片，加入 5ml 浓度为 5％的三氯乙酸(TCA)进行研磨。研磨所得匀浆在 3000r/min 下离心 10min。取离心后的上清夜 5ml，加入 5ml 浓度为 0.6％的硫代巴比妥酸(TBA)，混合后在沸水浴中煮沸 30min，冰浴下迅速冷却，再离心 10min。以 2ml 的蒸馏水和 2ml 0.6%TBA 混合液作为对照，分别测定上清夜在 450nm、532nm、600nm 处的吸光度 A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀。

丙二醛含量(μmol/g) ＝[6.45（A₅₃₂－A₆₀₀）－0.56A₄₅₀]V/W

V上清液体积(ml) W样品鲜重(g)

3.3 ACC合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）活性的测定

ACS和ACO活性的测定参照Inaba等(1995)和Ma等(2005)的方法并作了适当改进。取液氮冷冻的荷花样品(鲜：3g),在液氮中研碎，加入120mg PVP，用5mL提取缓冲液(lOOmM磷酸钾,pH8.5,5mM二硫苏糖醇，5uM磷酸吡哆醛，30mM抗坏血酸钠，10%甘油)匀浆；匀浆液在4℃下10000rpm离心20 min，重复离心一次；取上清液先用0.45um的滤膜过滤，然后将滤液缓慢加入预先用平衡缓冲液(100mM磷酸钾，pH8.5，5mM二硫苏糖醇，5uM磷酸吡哆醛)平衡过的SephadexG-25分离柱中，并用提取缓冲液洗脱进蛋白。上述操作均在4℃或着冰上进行。相同试验重复进行3次。

测定ACS活性时,取1mL酶液至小瓶屮，加入0.5mM SAM 100uL，密封混匀，于30℃水浴30min；水浴结束后，用100uL，50uM HgCl2终止反应，再加入0.3mL 5%NaClO与饱和NaOH的混合液(2：1，v/v)，冰浴20min，随后抽取1mL气样测定瓶内乙烯生成量。ACS活性用单位鲜重样品在单位时间内生成的ACC含量标示，单位为 nmol g^-1FWh^-1。相同试验重复3次。含量表示，单位为nLg^-1FWh^-1。相同试验重复进行3次。测定ACO活性时，取1 mL酶液至小瓶中，并依次加入20mM ACC 100uL，2mM FeS0₄ 100uL,密封后用微量注射器注入30mM NaHCO₃ 10uL，混匀置于30℃水浴30 min；水浴结束后,抽取1mL气样测定瓶内乙烯生成量。ACO活性用单位样品在单位时间内生成的乙烯

3.4 荷花乙烯生成量测定

乙烯生成量的测定采用气相色谱仪法。分别从各处理中随机选取3株荷花幼苗，记录荷花苗鲜重，并将其各自瓶插后放在带橡胶塞的玻璃罐内，常温密封1h，随后抽取2mL气样,利用气相色谱仪测定整株荷花幼苗的乙烯生成量，每个样品重复测定3次。乙烯生成量的单位为nL g^-1FWh^-1。气相色谱仪工作条件：柱箱温度6℃，填充柱GDX02，汽化温度：150℃，检测器温度：180℃，空气流量为30mL min^-1,氢气流量为30-40mL min^-1。

3可行性分析

试验用的微山湖红莲种子储备充足，具备培养荷花的条件及技术手段；常规试验及重金属试验相关的仪器设备完善，实验药品齐全；ACS、ACO酶活性测定和乙烯释放量测定方法熟悉，具备相关的试验操作和数据分析能力。

4. 研究创新点

特色或创新之处

国内外现在已经证明乙烯参与并调控了植物对于非生物胁迫的响应，但是乙烯是否参与并调控荷花重金属抗性方面的研究还未见报道。本试验拟进一步完善荷花耐cd性机制，并为荷花作为修复材料净化水体提供一定的参考。

研究计划及预期进展

5. 研究计划与进展

1.第一阶段（2014年5月~7月）：通过设立不同的镉浓度梯度，筛选出合适的cd处理浓度，以备今后实验之用；

3.第三阶段（2014年7月~10月）：通过cd的单独处理、cd和acc的复合处理、cd和sts的复合处理，观察荷花叶片受损状况并测定荷花内源乙烯的释放量。

4.第四阶段（2014年11月~2015年4月）：通过cd的单独处理、cd和acc的复合处理、cd和sts的复合处理测定acs、aco的活性，并进行相应的数据分析。