HtNHX12在BY2细胞中的表达及功能验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题研究背景和意义钾离子广泛分布于植物各组织和器官, 是植物体内含量最丰富的一价阳离子, 约占植物干重的2%－10%[1]。

钾元素在植物生长过程中起着非常重要的作用, 它参与植物生长发育中许多重要的生理生化过程, 如调节细胞膨压、维持细胞电荷平衡。

当植物在生长发育过程中钾营养供给不足时, 就会出现明显的缺钾症状, 表现为茎秆柔弱, 易倒伏; 叶片易失水, 耐旱、耐寒性降低; 蛋白质和叶绿素被分解, 叶色发黄, 进而导致组织坏死[2]。

2. 研究的基本内容和问题

本课题组前期从耐盐菊芋中克隆了两个钠（钾）氢逆向转运蛋白htnhx1和htnhx2同源基因，并发现它们对水稻耐盐和耐贫瘠上存在差异，且初步探究了htnhx1/2影响水稻耐盐差异的机理，比较了高盐，贫瘠或低钾胁迫下htnhx1或htnhx2对转基因水稻生长和产量的影响，并初步明确了这两个基因对水稻体内钾，钠的积累存在明显差异，htnhx2更有利于水稻低钾情况下的抗盐。

本课题希望将htnhx1/2这两个基因转入by2细胞中，借此进一步探究htnhx1/2在对细胞内积累钾钠的影响，并探索htnhx1/2在细胞水平上影响植物钾钠积累的机理。

同时，考虑到htnhx1和htnhx2在细胞中的表达部位不同，结合氨基酸序列比对结果，通过和atnhx56的氨基酸序列相比较 ，发现有8个氨基酸序列可能对基因的亚细胞定位结果起重要作用，因此我们对htnhx1进行了改造得到del1，希望验证这8个氨基酸的功能。

3. 研究的方法与方案

利用已构建好的htnhx1、htnhx2、del1载体，通过农杆菌介导侵染法将htnhx1、htnhx2、del1基因转入到by2细胞中，利用卡那霉素逐步筛选获得稳定遗传的转基因细胞系。

观察基因的亚细胞定位； 利用低钾高盐的营养液处理htnhx1、htnhx2、del1转基因细胞系，培养六天后测定细胞内钾离子含量。

技术路线见附件

4. 研究创新点

本课题组前期从耐盐菊芋中克隆了两个钠（钾）氢逆向转运蛋白HtNHX1和HtNHX2同源基因，发现这两个基因在细胞中定位在不同部位，HtNHX1在液泡上而HtNHX2在小囊泡上，我们并发现它们对提高水稻耐盐性相似但是HtNHX2还能提高水稻耐贫瘠性。

并且我们通过比对发现了可能决定定位的8个氨基酸序列，并对HtNHX1基因进行了改造，有望进一步揭示HtNHX12基因的工作机理。

5. 研究计划与进展

2015.02-2015.03文献查阅，设计实验方案；2015.03.01-2015.03.10 农杆菌侵染BY2细胞；2015.03.10-2015.04.10 潮霉素筛选得到稳定的转基因细胞系；2015.04.10-2015.04.20提取DNA验证；2015.04.20-2015.04.30低钾高盐溶液处理细胞并测定细胞的K 、 Na 含量；观察亚细胞定位；2015.05.01-2015.05.30 整理实验数据并撰写论文。