1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
中国农作物秸秆资源丰富，据统计我国每年产生约7亿t 左右的秸秆废弃物，秸秆的主要成分是：纤维素含量25-30%，木质素含量10-20%，半纤维含量15-25%，其余还有少量的水分、无机盐和糖分[1]。所以它是一种可以被利用的生物资源，如果将它进行生物的处理，一方面减少了因随意焚烧带来的污染物质的排放，对环境保护起到了很大的作用；另一方面，使废弃的物质与能量得到了最大程度的回收与利用，故如何利用多种方式解决作物秸秆的处理问题日渐成为了学者们竞相研究的热点问题。
目前，自然界中纤维素只有一少部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。中国是一个农业大国，每年都有大量的农作物秸秆产生[2]。传统上秸秆多作为农村薪材或以堆积、荒烧等形式倾入环境中，现如今国内愈演愈烈的雾霾天气的形成与秸秆的肆意焚烧有密不可分的联系。而与此同时，以玉米、小麦等为代表的秸秆类物质又是一类优质的可利用资源。随着现代农业的不断发展，秸秆资源化利用的途径也越来越多，包括秸秆能源化、秸秆饲料化、秸秆用作工业原料以及用作肥料等。在秸秆资源化的过程中，如何更快更好地降解以纤维素、半纤维素和木质素为主要成分的秸秆则成为了解决这一问题的重点和难点。因此近年来对农作物的秸秆处理问题的研究越来越多。由于作物秸秆组成成分结构的复杂性，不易降解成为生产中的障碍，特别是在以种植业为主的地区，秸秆在短期内不易腐解，加上直接还田影响墒情和耕作，导致废弃和焚烧秸秆的现象遍及广大农村区域，由此引起环境的污染和资源的严重浪费，因此获取高效降解秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂是解决我国严峻秸秆问题技术的关键[3]。就目前我国现状而言，全国用作还田和生物肥料的作物秸秆仅占总量的20%左右，焚烧占17%，尚有50%未被有效利用。秸秆还田具有增加农田土壤有机质的含量和质量，培肥地力，缓解土壤中氮、磷、钾肥比例失调的矛盾，调节土壤的物理性能，改造中低产田，形成土壤有机质覆盖，抗旱保墒，增加作物产量，提高土壤增产潜力、优化农田生态环境等优点[4]。
作物秸秆高效利用的关键问题是选育高产优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。产纤维素酶的生物种群相当广泛，如细菌、真菌、放线菌及昆虫等，而且同一微生物也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别[5]。因此，各国学者目前仍然在进一步选育优良性能的菌株，特别是一些极端环境下(如高温、广适pH)的高活性纤维素分解菌。一般而言从自然界直接选育得到的原始菌株的酶活性不高，酶组分不全，通常需要遗传改造。对分解纤维素的微生物的进一步选育研究仍将是今后纤维素酶高产菌和纤维素酶的发展趋势[6]。
微生物是产生三素酶的主要来源（表1），在秸秆物质的降解过程中发挥了巨大的作用，但不同微生物产生的三素酶的能力差异很大。一般地，纤维素和半纤维素被细菌、放线菌和真菌所分解，木质素被真菌和细菌所分解[7]。不同的土壤肥沃程度对纤维素分解菌的分布影响很大。贫瘠土壤中主要是真菌，较肥的土壤则以细菌为主[8]。在有氧中温条件下[9]，强烈分解纤维素的真菌是木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)的一些种，其中尤以木霉属受到充分重视。研究表明，只有木霉菌才含有完全水解纤维素所必须的纤维素酶的3种组分，即微晶纤维素酶、CMC酶（羧甲基纤维素酶）以及纤维二糖酶（β-葡糖苷酶）[10]。近年来陆续发现很多好热的真菌[11]，如特异腐殖霉（Humicolainsolens），其纤维素酶耐65 ℃～70 ℃，在堆肥的高温阶段，这些高温纤维素分解菌在植物秸秆的加速分解中起作用，这在堆肥过程中能加速其分解进程，缩短发酵时间。
分解纤维素的细菌种类远不如真菌多，但在土壤等环境中的数量却不少[12]，我国土壤中所含的分解纤维素的细菌为104/g干土。分解能力较强的有食纤维菌（Cytophaga)、生孢食纤维菌(Sporocytophaga)、多囊纤维菌(Polyangium cellulosum)等。分解木质素通常在有氧条件下进行。用14C测定或在木质素上生长等方法研究表明，从麦秸中化学分离的木质素可被假单胞菌(Pseudomonas)等代谢达50%。一般而言细菌降解木质素的能力比真菌低得多。
表1 产生三素酶的微生物种/属一览表
细 菌 | 真 菌 | 放线菌 | |
纤维素酶类 | ① 兼性厌氧微生物：食纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)、生孢食纤维菌(Sporocytophaga)、多囊纤维菌(Polyangium cellulosum)、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum）、球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）、双酶梭菌（Clostridium bifermentans）等; ② 好氧微生物：粪碱纤维单胞菌（Cellulomonas fimi）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）、混合纤维弧菌（Cellvibrio mixtus）、噬胞菌属（Cytophaga）等； | 里氏木霉（Trichoderma Reesei）、绿色木霉（Trichoderma viride）、米根霉（Rhizopus oryzae）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、 黑曲霉（Aspergillus niger）、镰刀霉(Fusarium spp.)、 拟青霉(Paecilomyces Bainier） 斜卧青霉（Penicillium decumbens）等。 | 分枝杆菌(Mycoba- -cterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、 小单孢菌(Micromonospora)、唐德链霉菌(Streptomyces tendae) 及该属中的部分菌 等。 |
半纤维素酶类 | 热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum）、溶纤维丁酸菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus. pumilus）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）等。 | 黑曲霉（Aspergillus niger）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、拟青霉菌属（Paecilomyces Bainier）、青霉（Penicillium）、酵母菌的部分菌（Saccharomyces sp.）等。 | 白浅色链霉菌(Streptomyces albogriseolus)、诺卡氏菌形放线菌(Nocardioform actinomycetes)等。 |
木质素酶类 | 假单胞菌的某些种(Pseudomonas sp.) | 白腐菌（Phanerochaete Chrysosprium）、褐腐菌（Lentinus edodes）、黄孢厚毛平革菌（Phanerochete chrysosporium）、彩绒草盖菌（Coridusversicolor）、变色栓菌（Thametes versicolor）、射脉菌（Phlebiaradiata）等。 | 链霉菌（Streptomyces）、诺卡氏菌（Nocardia）、节杆菌（Arthrobacter）、小单孢菌（Micromonospora）等。 |
由于涉及生物安全及基因污染问题，通过理化诱变方式或基因重组产生高纤维素酶活菌株的应用得到限制。分解秸秆的三素酶是多酶体系，酶组分之间存在着明显的协同作用，要求多菌株的配合、相互补充，才能促进纤维素类物质的分解，尤其是细菌与真菌之间具有比较强的相互作用。因此，秸秆高效利用的一个重点还是从自然环境中筛选高效产酶菌株，分别针对木质素和纤维素进行快速降解，再通过优化配比，组合成为快速腐解秸秆的高效菌剂，使该项技术具有广阔的应用前景。
参考文献：
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2. 研究的基本内容和问题
1.1 研究目标：
本项目拟通过从不同自然环境和生态系统中分离、筛选和纯化得一系列具有纤维素降解能力的菌株。选用作物的秸秆作为唯一碳源对菌株进行复筛并测定其产生纤维素类酶的活性，通过细菌的理化特性和细菌的16s rrna 测序及序列分析进行鉴定。并通过秸秆失重试验对其降解效果进行评价，为作物秸秆的高效利用构建高效分解菌剂。
1.2研究内容：
3. 研究的方法与方案
1研究方法
（1）初筛：滤纸平板法培养，从较大降解斑挑选出菌群，富集培养后，稀释平板涂布。
（2）复筛：CMC刚果红培养基培养，通过染色观察降解圈大小。
（3）酶活力测定：CMC酶活、滤纸酶活、木聚糖酶活测定及秸秆失重实验。
（4）鉴定：菌株的理化特性和16s rRNA 测序及序列分析。
2 技术路线图：
见附件
3实验方案
（1）分离和纯化：将所采样品在灭菌后的滤纸平板上点样，培养一段时间后进行初筛，以初筛出的降解斑较大的菌群为对象，将其蛇形划线于牛肉膏蛋白胨培养基上进行富集。再将富集后的菌株接种于CMC-Na斜面培养基上复筛。
（2）酶活力测定：采用DNS法分别测定所选菌株的CMC、滤纸和木聚糖酶活。
（3）秸秆失重实验：秸秆失重率测定称取适量切碎的秸秆作为唯一碳源,接种菌液后于适宜条件下静止培养，离心，去上清液，用盐酸和硝酸混合液冲洗而消除菌体，离心，清水洗涤，离心后烘干并称重，计算失重量和失重率。失重率 = (腐解前稻草质量．腐解后稻草质量)／腐解前稻草质量100％。
（4）鉴定：16S rRNA 测序及序列分析。
4可行性分析
（1）微生物物种多样性 在自然环境中存在多种细菌具有纤维素降解能力，所以只要采用合适的方法就可以通过实验从自然环境中分离到具有这种能力的菌群。
（2）技术可行 现在对于纤维素降解菌的分离、纯化、鉴定技术已经相当成熟，以本实验室现有的设备条件完全可以完成纤维素降解菌的分离、纯化及鉴定等一系列工作。
（3）人员配备 本实验工作人员了解有关纤维素分解菌的相关知识，具备进行本实验所需能力，完成本实验的全部过程。
4. 研究创新点
特色或创新之处
之前的研究主要侧重于对单一菌株的研究，而对于单一菌株而言，其降解能力十分有限，而本实验的研究工作扩大了对纤维素降解菌的研究范围，为纤维素降解菌菌库提供了种质资源，有利于进一步进行复合菌株的研究5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
1. 研究计划
2014.122015.1 实验准备阶段，包括文献阅读、资料收集、熟悉实验室环境、学习基础实验操作等；
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