1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
植物凋落物是土壤有机质的重要来源[1]。凋落物中含有植物生长需要的氮磷等多种养分元素，是土壤中重要的养分来源[2]。凋落物还田后在土壤中分解，能有效提高土壤有机质的含量，改善土壤物理结构和微生物特征[3]。蚯蚓能破碎、分解和混合有机质，从而影响凋落物的分解过程[4]。尽管蚯蚓活动对凋落物分解过程的研究已经有较长一段时间，但是，目前关于蚯蚓如何通过影响微生物微生物群落而进一步影响土壤中碳的转化及养分的释放依然缺乏比较深入的研究。而其中由土壤微生物分泌的胞外酶是生物地球化学过程的重要驱动者，在生态系统土壤有机质转化和养分循环等过程中起着关键作用[5]。目前，国内外对蚯蚓作用主要集中在土壤中总微生物量及群落结构的研究上，虽然蚯蚓对土壤酶活性有着积极影响已被许多研究所证实[6]，但以往关于凋落物与蚯蚓相互作用的研究中培养时间往往较短，养分的释放主要还是可溶性组分[7]，并且，对凋落物特征还缺少比较详细和全面的了解，而凋落物特性本身不仅对土壤酶活性会产生重要影响也会影响蚯蚓的生态功能。
凋落物本身的性质决定了其分解和养分释放的速度，因而也就直接影响着微生物胞外酶的活性。以往研究比较常见的用于指示凋落物性质的指标主要有c/n比、木质素/n比、n及p的初始浓度等[8]。但有研究指出仅仅以这些指标并不能完全表征凋落物质量的高低，例如，在凋落物分解的后期，木质素、纤维素的含量以及酚类物质的含量往往才是影响分解过程的主要因素[9]。一般凋落物中c/n比越高、n的含量越低、木质素含量高，凋落物分解速率越慢。n素含量低限制了微生物的生长发育，导致了凋落物分解速率下降。增加n含量，可以促进微生物的活动，使关于n元素转化利用的酶活性增高，从而提高n的矿化速率，加速凋落物的分解[10-12]。此外，有研究表明凋落物的初始p含量以及c/p比也会影响其分解的快慢[13]。在凋落物分解过程中，木质素是最难分解的成分之一，只有特定的微生物能够将其分解，凋落物木质素的含量高低影响着凋落物的分解速率。木质素/n比值与凋落物分解速率呈显著负相关，有研究认为分解初期n含量是一个主要分解控制因素，在后期则由木质素主导，过高的木质素含量不利于土壤中相关微生物的利用，因而使其分解速率下降[14]。
蚯蚓作为陆地生态系统大型土壤动物区系最重要代表，具有较强调控土壤生态系统功能的潜力[15]。许多研究表明，蚯蚓与微生物的交互作用能够促进有机物料的矿化分解、土壤养分的转化循环，这些功能的实现都依赖于土壤酶活性。dempsey等[16]发现蚯蚓刺激了土壤纤维素酶和β-d-葡萄糖苷酶活性，促进了土壤c循环。陶军[6]等发现蚯蚓增强了土壤和蚓粪中多种酶的活性。以往研究表明，蚯蚓更喜好高质量的凋落物，但比较蚯蚓对不同质量凋落物的分解贡献时，结果可能与之相反。tian等[17-18]发现接种蚯蚓更有助于低质（高碳氮比、高木质素和酚类含量）植物残体的降解，并认为蚯蚓对低质量植物残体降解促进明显的原因是：由于高的碳氮比、高的木质素和酚类含量，土壤微生物对低质量植物残体的分解率低，接种蚯蚓后通过蚯蚓的作用将凋落物粉碎，从而增加了土壤微生物可接近的表面积们，由此提高凋落物转化利用的效率；而高质量植物残体由于低的碳氮比、低的木质素和酚类含量，土壤微生物对高质量植物残体的分解率高，因而蚯蚓对该类植物残体分解的贡献反而不大[19-20]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标、内容：
本实验旨在研究通过施用不同化学特征的植物凋落物，接种或者不接种蚯蚓，判断凋落物性质和蚯蚓活动对土壤微生物活性的影响，通过凋落物的化学组成成分与蚯蚓的相互作用对微生物活性影响，从机制上讨论蚯蚓和凋落物化学组成如何影响土壤中养分含量。
拟解决的关键问题：
3. 研究的方法与方案
①研究方法 通过设计室内培养试验，分别以是否接种蚯蚓和添加不同碳氮质量比的凋落物为两种处理因素进行两因素完全交互设计，通过测定比较不同试验处理中土壤微生物群落活性，揭示蚯蚓与不同质量凋落物相互作用的机制。
②技术路线
不同C/N比凋落物 |
（接种蚯蚓） （不接种蚯蚓）
土壤微生物群落化学计量 |
微生物群落结构 |
微生物量 |
微生物活性 |
土壤养分水平 |
③实验方案
3.1 试验方案
试验：研究施加不同碳氮比凋落物，接种或不接种蚯蚓对土壤养分水平的影响
１）培养土壤：批量土壤采自江苏南通。取样深度0～20 cm。土壤采回后即进行预处理，用孔径为2 mm筛子筛分，剔除肉眼可见的根系、有机残体及大中型土壤动物。
２）凋落物秸秆：均粉碎过1mm筛后烘干，施加量为37.5g（2.5%土重）；
３）接种蚓种：为威廉腔环毛蚓。接种密度为每个盆钵（1.2kg干土）接种三条成年蚯蚓（生物量约7.5g)，在接种蚯蚓前调解土壤含水量为土壤最大持水量的60%。
４）培养时间：通过测定土壤呼吸，在呼吸值达到平稳后进行采样（90天）
3.2试验材料
试验材料包括：
1） 威廉腔环毛蚓：来自江苏省南通市菜地；
2） 凋落物：采自南京农业大学江浦农场附近荒地
3.3采集时间和方法
1）采用时间：通过测定土壤呼吸，在呼吸值达到平稳后进行采样（90天）
2）土壤样品：将土壤从盆钵中取出，将土掰散后挑出蚯蚓，将土壤混匀后随机取样。
3.4 测定指标及方法
3.4.1凋落物特征
l 凋落物全碳、氮、磷含量：碳氮使用元素分析仪测定，磷使用钼锑比色法测定
l 凋落物可溶性碳、氮、磷含量：同上
l 可溶性糖的测定：采用蒽酮比色法。
l 可溶性蛋白质的测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法。
3.4.2土壤样品
1） 土壤生物学指标
l 土壤呼吸：使用气象色谱仪分析测定。
l 微生物量碳、氮、磷：采用氯仿熏蒸_硫酸钾溶液直接浸提法测定
2） 土壤物理化学性质
l 土壤全碳、氮、磷：分别使用重铬酸钾氧化法、凯氏定氮法、钼锑蓝比色法
l NH4 -NO3-的测定：采用0.01M CaCl2浸提，水土比10:1，浸提液中NH4 -NO3-运用流动分析仪测定。
l 有效磷测定：取过20目的风干土2.50g于100ml的振荡瓶中，加50ml 0.5M NaHCO3，加一勺无磷活性炭，振荡30min，过滤，取滤液10ml于50ml容量瓶中，摇匀，放置30min，在880nm波长处比色。
l 水溶性碳水化合物：取5.00g土加入去离子水25ml(水土比为5∶1 ) , 此后在室温下以200 rev min-1振荡1h 并以8000g离心10min, 用0.45m滤膜过滤, 滤液中碳水化合物用苯酚硫酸比色法测定。
l 土壤PH测定：称取过20目（孔径1mm）的风干土，水土比为1：2.5，采用PH仪测定。
④可行性分析
技术保障：由土壤生态实验室指导老师对本项目关键技术，如蚯蚓的接种和凋落物指标测定等进行指导。其余实验内容和项目测定可利用实验室现有设备开展。
工作积累：土壤生态实验室之前关于蚯蚓活动对土壤养分循环影响的研究成果为项目的顺利实施提供了基本条件。
团队配合：来自资环专业的同学对实验操作具有一定的实践基础，成员学习成绩优秀，对科研具有浓厚兴趣，成员之间紧密的合作和刻苦学习精神可以保证在短期内掌握实验需要的操作技术；并且我们组有对生态学及土壤学均颇有研究的老师负责统一指导。
4. 研究创新点
现有蚯蚓对土壤生态功能的影响研所采用的室内培养或盆栽试验培养时间较短，一般培养时间为六十天左右，但蚯蚓对凋落物的作用可能与时间产生交互作用，总体而言目前超过九十天的培养试验还比较少见。与此同时，试验选择了碳氮比例梯度较大从碳氮比最低的三叶草（碳氮比约为10）到碳氮比较大的甘蔗纤维（碳氮比约为140）共五种凋落物，再加上不加凋落物的对照处理，可以比较深入的探究不同质量凋落物与蚯蚓相互作用对土壤养分元素含量的影响。
5. 研究计划与进展
研究计划
2014.05~2014.06 查阅相关文献资料，完善试验设计；
2014.07~2014.09 凋落物准备与采集，开展预试验；
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