木质纤维素分解菌A.fumigatus Z5多糖单加氧酶家族基因克隆与功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义纤维素的分解是堆肥过程或纤维素工业利用中最重要的步骤之一，其过程主要由微生物分泌的纤维素酶来完成，如何提高酶的催化活力成为该领域研究的热点。

多糖单加氧酶（pmos）又称gh61家族蛋白，在二价铜离子和还原剂存在时，可以显著减少水解所需的酶量并显著提高转化效率。

本研究通过分析高效纤维素分解菌z5的基因组获得gh61基因家族基因的结构和蛋白信息，定量分析不同碳源诱导条件下pmos家族基因的转录差异，并表达和纯化其中表达量最大的pmos基因，获得其最佳催化条件和酶学参数；利用电子顺磁共振（epr）分析pmos活性中心的金属离子性质，并通过液质联用仪分析cdh和pmos催化纤维素的产物；利用pmos 与a.fumigatusz5和t.terrestris的粗酶液进行协同催化纤维素的水解。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标1）通过对菌株A.fumigatusZ5全基因组DNA的系统分析，找出能够编码GH61家族糖基水解酶的相关基因，并将其与已报道具有PMOs功能的基因进行序列分析，获得其相关的基因信息学；2）在不同的碳源诱导条件下，提取菌株A.fumigatusZ5的总RNA，并利用半定量RT-PCR的方法，研究GH61家族基因的表达特征；3）研究出一种能够快速并准确测定PMOs酶活力的方法；4）克隆并表达1-2个编码PMOs酶的基因并纯化其表达产物，同时获得PMOs相关的酶学催化特性；5）揭示PMOs催化纤维素分解以及与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制。

研究内容1）菌株A.fumigatusZ5 的GH61家族基因信息学分析；2） 菌株A.fumigatus Z5 的GH61家族基因表达特征研究；3） PMOs酶活力测定方法的研究；4） PMOs酶基因的克隆与表达及其特性研究；5） PMOs催化纤维素水解机制的研究；6） PMOs与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制研究；拟解决的关键问题1）菌株A.fumigatusZ5中所有GH61家族基因在不同的碳源诱导条件下的表达差异，以及菌株Z5中表达最佳的PMOs基因；2）快速准确测定PMOs酶活力的方法；3）PMOs与A.fumigatusZ5和T.terrestris的粗酶液进行协同催化纤维素的水解，及其协同催化提高木质纤维素分解的作用机制；

3. 研究的方法与方案

研究方法包括荧光定量与半定量法、PCR扩增、TA克隆法、CaCI2法制备大肠杆菌感受态等，具体请见附件。

4. 研究创新点

1)研究材料创新对于木质纤维素分解的研究，获得高产酶菌株是至关重要的。

本研究中使用的木质纤维素分解菌株z5，不仅能够分泌丰富的木质纤维素酶系，更为重要的是，它是一株高温产酶菌，能在高至70℃的温度下正常生长产酶，其分泌的木质纤维素酶系的最适催化温度也在50℃，在生物催化以及实际的应用过程中，可以节省物料冷却所消耗的资源与能源，提高生产效率。

菌株z5的另一个特点是所产酶系组成均衡，更利于pmos协同机制的研究。

5. 研究计划与进展

研究计划2014.9.1-2014.12.31：完成菌株A.fumigatus Z5中GH61家族信息学的相关分析，获得菌株Z5中能够编码GH61家族蛋白的基因信息，挖掘出菌株Z5木质纤维素分解的潜能；利用半定量的方法定量分析菌株Z5在不同的木质纤维素碳源的诱导条件，GH61家族基因的表达差异，确定出最佳的诱导底物和诱导条件；2015.1.1-2015.5.5：研究出一种能够快速精确测定分析PMOs酶活力的方法，为全面研究PMOs的功能提供一种直观的方法；通过GH61家族基因的分析结果以及不同碳源诱导的表达差异结果，选择菌株Z5中高表达的PMO基因进行克隆表达，并研究起的酶学特性以及催化参数。

预期进展1）获得菌株A.fumigatusZ5中所有GH61家族基因的信息，包括基因的结构、蛋白的二维和三维结构以及其与其他GH61家族基因的发育关系分析结果；2）获得菌株A.fumigatus Z5中所有GH61家族基因在不同的碳源诱导条件下的表达差异，确定菌株Z5中表达最佳的PMOs基因；3）获得一种能够快速准确的测定PMOs酶活力的方法；4）克隆、表达以及纯化PMOs，并研究PMOs的一些酶学特性和催化催化常数；5）揭示PMOs催化分解纤维素和协同催化提高木质纤维素分解的机制。