土壤生物多样性对土壤生物群落和功能稳定性的影响研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

生物入侵在全球范围内对生态环境，经济和整个社会都造成了严重的威胁。入侵种广泛地影响本地生物种类，危及土著群落的生物多样性并影响农业生产和人类活动，给农林牧副渔等产业带来巨大的经济损失。外来微生物的入侵改变土著微生物群落的组成和结构，影响整个土壤生态系统功能。同时，由于微生物入侵具有隐蔽性强、变异频率高、潜伏期短和危害严重持久等特点，使得微生物入侵极具破坏性。william指出大多数生物入侵的成功与外来种特性、环境条件和本地生物群落等因素关系密切。

土壤微生物在陆地生态系统中具有重要的生态功能，驱动陆地生态系统的物质循环和能量流动等。其作为土壤生态系统的重要生命体，其多样性代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制对群落的影响，土壤生物多样性丧失不仅影响土壤功能的正常发挥，而且降低了生态系统在面临多变环境条件下的功能稳定性。然而生态学研究领域有关多样性与生态系统过程和功能的实验研究多侧重于考查植物多样性，很少考虑土壤微生物多样性。长期以来，出于对生物多样性丧失可能引发的一系列不利影响(如生态系统服务功能下降和生态系统可持续性降低等)的担忧，有关生物多样性与生态系统功能关系的研究成为人们关注的焦点。

1生物入侵的影响因素研究进展

2. 研究的基本内容和问题

1.1研究目标：

1） 选择不同种类有益有害微生物，通过调控土著生物群落的多样性，验证生物多样性提高对生物入侵抗性的假说；

2） 阐明土壤环境条件和生物群落特征对外来微生物入侵影响的差异。

3. 研究的方法与方案

2．1实验材料

2．1．1供试土壤供试土壤为采自江苏省南通市如东县的长江冲积平原灰潮土，美国制土壤质地分类为粉壤土，种植制度为稻麦轮作。土壤基本性状为：土壤pH8.2、有机碳8.29gkg-1、全氮0.92gkg-1。土壤取样深度为0~20cm，鲜土采集后，剔除石块、大中型土壤动物及根茬等残体，然后掰碎过5mm筛，混匀调节土壤含水量为田间持水量的65%后，置于常温下备用。

2．1．2供试蚯蚓的准备实验用蚯蚓为土样采集地当地的优势蚯蚓种威廉腔环蚓（Pheretimaguillelmi），蚯蚓采回后，在经过预处理的土壤中预培养一周，待用。每盆钵接种成年蚯蚓8~10条，总生物量为19~21g，盆钵顶部加800mm筛网防止蚯蚓逃逸。

2.1.3微生物悬液的准备实验所用微生物为荧光蛋白标记大肠杆菌和土著微生物混合悬液。因为培养土壤在处理、过筛过程中慢慢干燥，为了重新获得原始培养土的土著微生物，将置于4℃冰箱中保存的新鲜原始土壤制成菌悬液，即称取10g土壤加入50ml蒸馏水中，振荡30min后通过22m微孔滤膜过滤，以去除土壤动物。得到的菌悬液随即按1%比例接种到土壤中。而同时为了表征蚯蚓活动对微生物迁移的协助，我们选择标记有绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的模式细菌种DH5α大肠杆菌（Escherichiacoli-DH5α）以下简称：E.coli-DH5α-GFP，将其与土著微生物悬液混合接种到土壤中。荧光蛋白标记大肠杆菌获取于南京农业大学江苏省有机固体废弃物利用重点实验室，该菌在365nm紫外光下能被激发出肉眼可见的绿色荧光（王晓辉，2010）。用含氨苄青霉素的LB液体培养基富集，接种量为1108cfug-1干土。

2．2实验设计

本实验采用的是长方体深蓝色塑料盆钵（图2-1），长、宽、高的比例是22cm17.5cm25.5cm。

本实验为室内3因子交互实验，三个因子分别为胁迫处理、接种蚯蚓和接种微生物。其中胁迫处理包括2个水平，分别为加热胁迫（Ht）和对照处理（不施加任何胁迫，CK）。在实验进行之前，对一半培养土壤进行加热胁迫，放在50℃恒温烘箱中24小时，然后将对照土壤（CK）和胁迫土壤（Ht）分别装盆，每个盆钵内的土壤用塑料板隔开，平均分为内外两层（见图2-2）。随即对外层土壤分别进行土壤微生物和蚯蚓的接种，包括4个水平，分别为不接种蚯蚓不接种微生物（CK）；不接种蚯蚓接种微生物（M）；接种蚯蚓不接种微生物（E）；接种蚯蚓接种微生物（EM）。待接种的蚯蚓与微生物稳定（24h）后立刻将隔板取出，使蚯蚓和微生物在整个盆钵中自由活动。

每个处理设8个重复，进行两次破坏性采样，每次采样每个处理随机选择4个重复。所有盆钵于25℃恒温暗室培养，定期加水保持湿度（65%田间持水量）。为了保证实验的随机性，各处理盆钵随机摆放，并做到每隔5天对盆钵位置进行随机调换。

实验设计

2.3样品采集

分别在培养后的第14天和第42天进行破坏性采样。采样时首先收集全部内层土壤，将内层土壤中的蚯蚓全部挑出。然后混匀内层土壤，放入自封袋中，于4℃条件下保存并迅速测定有关指标。然后将外层土壤中的所有蚯蚓拣出，结合内外部土壤中的所有蚯蚓，计算出每盆中土壤中蚯蚓的数量和生物量。

2.4测定指标及方法

2.4.1土壤可溶性碳土壤可溶性碳（DOC）：采用K2SO4溶液浸提法测定[。在25℃恒温条件下，称取相当于10g干土的新鲜土样，加入50ml0.5moll-1K2SO4溶液，200rmin-1振荡1h，在8000rpm下离心10min，上清液过孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜，滤液中的可溶性碳含量测定同土壤微生物生物量碳的测定方法相同。

2.4.2土壤微生物生物量和土壤微生物活性土壤微生物生物量碳（MBC）：采用氯仿熏蒸－硫酸钾溶液浸提法测定。具体步骤为：称取相当于10g干土（105℃下24h）的待测新鲜土样，加入1ml提纯后的氯仿拌匀，于25℃黑暗条件下密闭培养24h，然后用真空抽气泵（天津恒奥科技发展有限公司，HPD-25型无油真空泵）抽尽土壤残留氯仿，用0.5moll-1K2SO4溶液浸提，土液比为1:4（W:V）。280rmin-1振荡30min，定量滤纸过滤。熏蒸培养的同时，称取等量土样按照上述方法振荡浸提得对照滤液。吸取10ml滤液，用K2Cr2O4容量法测定溶液中的有机碳含量。熏蒸土样与未熏蒸土样的有机碳差值分别除以转换系数KC0.38，然后计算土壤中微生物生物量碳的含量。

2.4.3细菌与荧光标记大肠杆菌计数细菌与荧光蛋白标记大肠杆菌的计数采用稀释平板法，分别将土壤菌悬液稀释10、100、1000倍涂布在普通LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基上，置于25℃培养箱培养，分别在第一，二，三天计数菌斑数。细菌菌斑计数在日光下进行，荧光蛋白标记大肠杆菌菌斑计数使用MaestroGEMLB-16蓝光透射分析仪在365nm紫外光下进行计数测定。

2.5数据统计分析

数据分析采用SPSS16.0软件，分析前利用KolmogorovSmirnov和Levene法检验数据的正态分布及方差齐性，并在必要时利用对数转换和反正弦平方根转换以满足中数据的正态分布假设。利用一般线性模型中的重复测量方差分析法（Repeated-measureANOVA）分析不同采样时期蚯蚓活动对加热胁迫下土壤活性碳、氮和微生物学性质的影响。同一采样时间内加热胁迫、接种蚯蚓和微生物组合处理之间的差异采用最小显著极差法（LSD）进行检验（P0.05）。

2.4可行性分析

1）技术保障：由土壤生态实验室指导老师对本项目关键技术有丰富经验，其余实验内容和项目测定可利用实验室现有设备开展。

2）工作积累：土壤生态实验室前期相关预备试验、某些材料的准备确实为项目的顺利实施提供了基本条件。

3）团队配合：来自资环专业的同学对实验操作具有一定的实践基础，成员学习成绩优秀，对科研具有浓厚兴趣，成员之间紧密的合作和刻苦学习精神可以保证在短期内掌握实验需要的操作技术；并且有对生态学及土壤学均颇有研究的老师负责统一指导。总之，本项目研究目标明确、研究内容集中，是申请者所在课题组老师前期研究的拓展。土壤生态实验室是国家重点学科土壤学科重点建设的实验室，实验条件完全能满足本项目的需求。

4. 研究创新点

近年来，针对影响微生物入侵因素的研究开始受到全世界的关注。虽然大量研究表明土著生物群落对外来微生物入侵土壤生态系统成功率有决定性影响，但是有关外来种与本地生物相互作用影响的研究却相当缺乏，尤其是本地生物群落多样性因素对入侵的作用，使得相关机理研究进展缓慢。本研究采集施肥处理过得青藏高原土壤，利用缩微系统调控实验，选择不同种类的有益和有害微生物作为模式生物，设计不同浓度梯度的原土壤悬液代表土著生物群落的多样性，在研究思路和目标上具有较强的针对性。预期结果对于完善生物入侵理论，调控外来生物在土壤生态系统的功能，应对全球变化等干扰具有重要意义。同时，本项目还将利用微生物与生境的特殊关系，通过进行置换试验了解土壤环境条件和土著生物群落影响外来微生物入侵差异，也有助于更全面的考察影响外来微生物入侵的因素，因此本项目在研究方法上具有明显的创新型。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2015.3.4---3.11查阅相关文献资料，完成项目申报书；

2015.3.11---3.20预处理土壤，熟悉常规的无菌操作；