南京市及周边地区集约化养猪场粪便中雌激素污染特征开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

(一)国内外研究概况 环境雌激素可对生物体自身激素的合成、分泌、活性等产生干扰或对机体产生类激素作用，从而对生物体的繁殖、生长、发育及行为等产生不利影响^[1-3]。环境雌激素既可生理分泌，也可人工合成。因其具有较强的内分泌干扰性，环境雌激素已引起广泛的关注和研究，最早可追溯到20世纪90年代中期。有研究报道在畜禽养殖场附近河水中检测出高浓度雌激素，并发现其中某些鱼类出现雌雄同体现象^[4-5]。杨丹等^[6]讨论了双酚A对机体的危害及可能的作用机制。Chi Zhang等^[7]总结了近年来对世界范围内多种水体类型中雌激素的研究概况，分析了雌激素污染问题的严峻形势。环境雌激素已被列入首批持久性有机污染物名单。 随着我国养殖业的快速发展，畜禽养殖场粪便已然成为环境中雌激素的一大来源^[3,8],这主要是因为畜禽动物正常生理排泄及养殖场促生长激素药物的使用。由于农村产业结构的调整和人们生活需求的增长，畜禽养殖正逐渐成为南京市各区县的重要产业^[9]。畜禽养殖业在走向规模化、标准化的同时，也出现了诸多问题。多数养殖场的建设缺乏科学规划和必要的污染处理设施，畜禽粪便的大量堆置、农用可能会导致雌激素及其代谢物进入到土壤和水生环境中，对生态环境和人类健康造成危害^[10]。张绪美等^[11]通过估算得出江苏省共有23个县（市或郊区）的畜禽粪便已对环境造成威胁，其中畜禽粪便污染严重的地区大多靠近水体。然而，关于对各类畜禽粪便中雌激素污染状况的排查却鲜有报道，亟待开展此类调查，完善相关基础数据库。（二）本课题研究意义及应用前景 畜禽养殖业的快速发展与宏观环境管理水平的落后，产生了畜禽粪便雌激素排放水平的数据空白。本课题以四种代表性环境雌激素为研究对象，调查、分析南京市及周边地区集约化养猪场粪便中雌激素的排放状况^[12]，阐释猪粪便中雌激素的排放特征和污染状况，完善畜禽粪便中雌激素调查基础数据库，为后续畜禽粪便的高效管理及无害化、资源化处置提供基础数据支持，规避环境风险。

主要参考文献：[1]丁晓妹，李向阳，张明泉.环境激素浅析[J].环境科学与技术，2010,33（6E）：144-149.[2]孙小红，李婕，葛安靖.环境雌激素的生殖和发育毒性研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2013,21（4）：1-2.[3]李晓曼，黄斌，孙雯雯，等.类固醇雌激素环境行为研究进展[J].环境化学，2014,33（8）：1276-1283.[4]Belfroid A C ,Van Horst A , Vethaak A D , et al . Analysis and occurrence of estrogenic hormones and their glucuronides in surface water and waste water in the Netherlands[J]. Science of the Total Environment,1999,225(1-2):101-108.[5] ]Jobling S , Nolan M ,Tyler C R ,et al. Wide spread sexual disruption in wild fish[J]. Environmental Science Technology,1998,32(17):2498-2506.[6]杨丹，李丹丹，刘珊珊，等.双酚A对机体的影响及其作用机制[J].现代预防医学，2008,35（17）：3280-3282.[7]Chi Zhang，Yi Li，Chao Wang ,et al. Occurrence of endocrine disrupting compounds in aqueous environment and their bacterial degradation : A review[J]. Critical reviews in environmental science and technology, 2016,46(1):1-59.[8]李春花.农业生产带来的环境雌激素问题[C].银川，2010. [9]秦海旭，卢宁川，刘海滨.南京市畜禽养殖业现状及其污染防治对策[J].安徽农学通报，2013,19（6）：135-137.[10]陈蕾，王郑，曹世玮.畜禽养殖排放的雌激素对周边水体环境的影响[J].生态环境学报，2014,23（2）：359-364.（2）：359-364. [11]张绪美，董元华，王辉，等.江苏省畜禽粪便污染现状及其风险评价[J].中国土壤与肥料，2007（4）：12-15.[12]付银杰，凌婉婷，董长勋，等.应用UE-SPE-HPLC/FLD法检测养殖业畜禽粪便中雌激素[J].应用生态学报，2013,24（11）3280-3288.

2. 研究的基本内容和问题

（一）研究目标 初步了解南京市及周边地区养猪场雌激素的排放特征和污染水平，完善畜禽粪便中雌激素调查基础数据库，为后续畜禽粪便的高效管理及无害化、资源化处置提供基础数据支持，规避环境风险。

（二）研究内容 本课题主要以四种代表性环境雌激素为研究对象，调查南京市及周边地区集约化养猪场粪便中雌激素的排放水平。

采集典型养猪场不同时期的粪便样品，借助已确定的色谱分析手段，测定其雌二醇（17β-e2）、雌三醇（e3）、双酚a、炔雌醇等主要环境雌激素的含量及分布，阐释猪粪便中雌激素的排放特征和污染状况。

3. 研究的方法与方案

（一）研究方法 本课题采用实验研究与理论分析相结合的方法，采用超声提取-固相萃取净化-高效液相色谱法测定粪样中雌激素。（二）实验方案1.粪样制备 在南京市及周边典型集约化养猪场，采集新鲜猪粪样品，黑色塑料袋密封，尽快运回实验室，冷冻干燥处理。冻干后粪便样品用研钵研磨，过20目筛后避光、冷冻保存待用。2.粪样中雌激素含量的测定 自制萃取柱：订制6ml固相萃取玻璃柱管，在柱管底部填入一定量玻璃棉，称取（200 1）㎎填料加入空柱管中，轻轻敲打柱身使其均匀，将填料填平、压实，加入2ml甲醇润湿填料，上层再覆盖一层玻璃棉，再以洁净的玻璃棒按压使其装填紧密，保存待用。 标准溶液配制：分别准确称取4种雌激素（10.000.01）㎎置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到浓度均为1.00 g/L的单一标准储备液，于-20℃条件下保存。分别取100μL，分别用甲醇溶液定容至100ml棕色容量瓶中，得到浓度均为1.00㎎/L的混合标准储备液，于-20℃条件下保存待用。 样品预处理：称取（1.000.01）g粪样于30ml玻璃离心管中，加入20ml提取剂（乙酸乙酯），涡旋30s后超声提取30min，并以4500r/min离心30min，上清液转入另一离心管，重复提取1次，合并提取液，离心20min，取上清液用氮气缓慢吹干，甲醇溶解、超纯水稀释至50ml于容量瓶中待用。 固相萃取：自制C18固相萃取柱，用5ml甲醇和5ml超纯水活化，然后将提取后的样品溶液以3~5ml/min流速过固相萃取柱，用5ml超纯水淋洗柱体并继续抽吸3min，淋洗后的萃取柱用15ml体积比为1:1的甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液收集至小试管中)将小试管40℃恒温水浴并用氮气缓慢吹干，然后加入甲醇溶液涡旋混合，将附着物重新溶解至2ml，过0.22μm孔径滤膜后，用于HPLC/FLD分析。 分析检测：经Inertsil ODS-SP-C18（150 mm 4.6 mm, 5 μm）反相色谱柱分离四种雌激素，高效液相色谱/荧光检测器（HPLC/FLD）检测。

（三）可行性分析：1.具有重要的科学意义和实践价值。研究成果可完善畜禽粪便中雌激素调查基础数据库，为后续畜禽粪便的高效管理及无害化、资源化处置提供基础数据支持，规避环境风险。2.具有良好的基础。在实验之前作者已经通过查阅文献等途径对研究课题有了较充分的了解。3.具备良好的软硬件设施。课题组实验室拥有实验所需的各项实验器材，各种试验用品准备齐全。4.指导教师近年来开展了大量相关研究工作，在本课题研究方向已积累大量的经验，能够在以后的研究工作中起到很好的指导作用。

4. 研究创新点

目前南京市畜禽养殖粪便中雌激素排放水平的相关数据尚不完善，本研究的成果有助填补相关数据库空白。

5. 研究计划与进展

1月 1日-3月15日 查阅相关论文、书籍，进行知识和技能储备；

制定具体实施计划；

按照实验方案开展实验；