芘高效降解内生菌的筛选与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

土壤是人类赖以生存和发展的重要基础。目前，由于土壤有机污染引起的植物污染风险已经成为全球关注的焦点问题之一^[1]。多环芳烃（polycyclic aromatichydrocarbons, pahs）是由两个或两个以上苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式稠合在一起的化合物^[2，3]。它们是一类普遍存在于土壤环境中，具有三致效应（致畸、致癌、致突变）的持久性有机污染物，能够被植物吸收积累，并通过食物链的传递严重危害动物和人体健康^[4，5，6]。因此，如何规避植物体内pahs污染风险，保障农业的健康、可持续发展成为研究者亟需解决的问题。芘作为pahs中四环污染物的典型代表，常被用作测定环境中pahs污染的指示物和pahs生物降解的模型分子。本研究选择芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选高效芘降解细菌，探索其在不同碳源下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。

国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

本研究选择芘为目标污染物，从多环芳烃污染场地采集植物，旨在从植物体内分离筛选高效芘降解细菌，探索其在不同碳源下对芘的降解能力，以期为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。在此基础上，探索出一条应用植物体内的微生态系统来有效规避有机污染风险的新途径，进而为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提供重要依据。

3. 研究的方法与方案

技术路线：

实验方案：

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 生物材料

供试植株采自南京市江宁扬子石化芳烃厂排污口区。辨明植物品种。植株生长良好，采集后立即带回实验室进行内生细菌的分离筛选。

1．1．2 化学试剂

芘 ( 纯度98 ) 购于德国Fluka公司，分子量202.26 gmol^-1、纯水中溶解度为0.12 mgL^-1、辛醇-水分配系数 (logK_ow ) 为5.18。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

PCR引物购自上海英骏生物技术有限公司。

1．1．3 培养基

LB培养基：蛋白胨 10 gL^-1，酵母粉 5 gL^-1，NaCl10 gL^-1，蒸馏水 1000mL，pH 7.0 ~ 7.2。固体培养基加15-20g琼脂(1L)。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

无机盐培养基 (MSM )：(NH₄)₂SO₄ 1.50 gL^-1，K₂HPO₄3H₂O1.91 gL^-1，KH₂PO₄0.50 gL^-1，MgSO₄7H₂O0.20 gL^-1，微量元素溶液2 ml，蒸馏水1000 mL，pH7.0 ~ 7.2。固体培养基加15-20g琼脂(1L)。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

微量元素溶液：CoCl₂6H₂O 0.1 gL^-1，MnCl₂4H₂O0.425 gL^-1，ZnCl₂0.05 gL^-1，NiCl₂6H₂O0.01 gL^-1，CuSO₄5H₂O0.015 gL^-1，Na₂MoO₄2H₂O0.01 gL^-1，Na₂SeO₄2H₂O0.01 gL^-1。

芘降解培养基：5mgmL^-1的芘丙酮溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完，加入已灭菌的MSM培养液，芘的终浓度为50 mgL^-1。

磷酸盐缓冲液：K₂HPO₄H₂O 21.75 gL^-1，Na₂HPO₄12H₂O33.4 gL^-1，KH₂PO₄48.7 gL^-1，NH₄Cl5.2 gL^-1。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1．2 具有降解芘功能内生细菌的分离筛选

1．2．1 植物样品采集

南京市江宁扬子石化芳烃厂排污口区，辨别植物。

1．2．2 筛选方法

植物样品表面消毒：将新鲜植株用无菌水冲洗干净，置于无菌操作台内用75酒精漂洗3 ~5 min，依次用无菌水冲洗3 ~ 4次，0.1次氯酸钠溶液漂洗3 ~ 5 min，无菌水再冲洗数次。将经表面消毒的植物样品移入LB固体平板上，30 ℃培养24 h后，检查平板上是否有细菌生长。

稀释涂布：将经检测表面已完全消毒好的植物样本移入无菌研钵中，用灭菌的剪刀剪碎，加入无菌水充分研磨，取上清液梯度稀释（10^-1、10^-2、10^-3）并涂布于50mg/L菲降解固体培养基平板上和50mg/L芘降解固体培养基平板上，28℃恒温培养。设置空白组为无菌水涂布于50mg/L菲降解固体培养基平板上和50mg/L芘降解固体培养基平板上。

挑菌落形态有差异的菌划线纯化：待平板上长出菌落后，用划线分离方法，经过分离、筛选、纯化的反复过程得到纯化的典型菌落，挑选有明显降解圈且长势旺盛的菌株。

1．3 菌株鉴定

1．3．1 菌株16S rDNA序列同源性分析测定

（1）提取菌体总DNA：采用DNA提取试剂盒提取菌体总DNA。

（2）菌株16SrDNA的PCR扩增

16SrDNA克隆所用正向引物为16S-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为16S-1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(上海英骏生物技术有限公司合成 )。

PCR反应体系 ( 25 mL )：Premix12.5 mL，模板DNA 1 mL，引物16S-27F和引物16S-1492R0.5 mL，重蒸水10.5 mL。PCR扩增条件：⑴ 预变性：94 ℃ 4 min；⑵ 变性：94 ℃ 30 s，退火：55 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，30个循环；⑶ 终极延伸：72 ℃ 10 min；⑷ 保温：10 ℃ 10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物的纯化测序由南京金斯瑞测序有限公司完成。

1．3．2 菌株系统发育树

利用菌体形态观察并结合16SrDNA序列同源性分析对菌株进行鉴定,确定其分类地位。16SrDNA序列通过Genbank进行Blast比对分析、整理后，采用Clustalx1.83和MEGA5.0软件构建系统发育树。

1．4 芘降解试验

菌悬液的配制：将具有降解效果的菌株接种到LB液体培养基中，150rmin^-1、30 ℃摇床培养2d，8000rmin^-1离心10 min，弃上清液后，加入磷酸盐缓冲液使菌体混合均匀，再次离心，重复2-3次，用磷酸盐缓冲液调整菌悬液OD_600nm值，直到将其OD_600nm值调整到1.0为止，并于4 ℃下保存备用。

在芘浓度为40 mgL^-1的MSM培养基中，按5的接种量加入菌悬液 ( OD_600nm值为1.0 )，30 ℃、150 rmin^-1摇床培养10 d，定时取样，以不接种培养基做空白对照，实验重复3次。用高效液相色谱仪 ( HPLC ) 测定培养液中芘浓度。

芘浓度测定采用定时整瓶提取培养基的方法^[20]。向培养基中加入等体积色谱甲醇，30 min超声萃取，高速离心后过0.22 μm滤膜，用岛津高效液相色谱 ( LC-10AT ) 测定芘浓度。高效液相色谱设定参数：Inertsil ODS-SP-C18反相色谱柱 ( 150 mm 4.6 mm，5 μm )，流动相甲醇：水90：10，流速1.000 mLmin^-1，柱温40 ℃，检测波长245 nm，进样量20 μL。

1．5 不同碳源对芘的降解效率的影响

主要研究葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及麦芽糖这几种碳源对芘降解的影响。在芘降解培养基中另外添加碳源（10gL^-1），碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及麦芽糖，摇床培养7天后测定培养基芘浓度，并计算芘的降解速率。以不接菌的MSM培养基作为空白对照。

可行性分析：

该研究有充足的理论基础支持，该课题所需的实验仪器及器材完备，实验材料可寻，实验操作方法清晰，具有较强的研究可行性。

4. 研究创新点

本研究从多环芳烃污染场地采集植物，从植物体内分离筛选高效芘降解细菌，探索其在不同碳源下对芘的降解能力，为利用芘降解特性植物内生细菌防治土壤污染提供菌种支持。研究结果可为利用植物体内的内生细菌来有效规避作物有机污染风险提供重要思路和途径。

5. 研究计划与进展

2016年3月，油菜水培实验，不同浓度芘污染处理。

2016年4月-5月，探讨芘污染对植物内生细菌群落结构的影响。

本项目拟以pahs中的芘为目标污染物，在芘污染植物的基础上，研究不同浓度的芘污染对植物内生细菌群落结构的影响，探讨出植物内生细菌群落结构对多环芳烃污染的响应。在此基础上，综合地评价利用植物功能内生细菌调控植物吸收有机污染物的可行性，探索出一条应用植物体内的微生态系统来有效规避有机污染风险的新途径，进而为防治土壤有机污染、保障污染区农产品安全、减低农作物有机污染风险、合理利用污染土壤资源等提供重要依据。