琼脂酶基因agaWJ2的克隆、表达和酶学性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题意义：

随着人类对资源的不断探索和利用，陆地资源越来越匮乏，现在人们逐步把目光转移到蕴藏巨量资源的海洋。海洋约占地球总面积的71%，拥有丰富的藻类资源，主要有红藻、蓝藻、硅藻、绿藻等，人们通过物理、化学和生物方法从藻类中提取各种具有价值的物质，琼脂就是其中一种。琼脂也可称作琼胶，是从红藻类海藻中提取的一类天然多糖物质。在实验室里，琼脂作为一种难以降解利用的惰性物质，具有很好的稳定性，常作为培养基的支持介质。得益于其稳定性，在食品工业上琼脂作为增稠剂、稳定剂、悬浮剂、凝固剂和乳化剂等使用，是工业用途最为广泛的海藻胶之一。在我国琼脂的生产主要来源于江篱。

然而目前对于红藻资源的开发利用产品仍多限于生产琼脂、作为化工及医药等原料出口，不仅附加值低，且严重污染环境^[1]。因此，有效利用红藻资源，生产具多种生物活性的琼脂寡糖等高附加值产品，在增加经济效益、防止资源浪费、保护环境等方面具有重要意义。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标：将筛选到的琼脂酶基因agawj2进行成功克隆，并在大肠杆菌中重组表达和纯化，随后对表达产物进行最适温度、最适ph值、温度稳定性、ph值稳定性等酶学性质鉴定。

二、研究内容：分析实验室分离菌株 cohnella sp. lgh 的全基因组序列，获得一个预测编码琼脂酶的基因，将其克隆到表达载体中,并在大肠杆菌中进行表达，使用dns法验证该基因是否编码琼脂酶。纯化后的表达产物经sds-page检测其相对分子质量并测定其酶学性质。

三、拟解决的关键问题：

3. 研究的方法与方案

一、研究方法：

1.琼脂酶(agaWJ2)的克隆：

1.1构建PCR体系

PCR体系（50ul）：酶Prime Star max 25ul

引物P1 1ul

引物P2 1ul

DNA 1ul

无菌水 22ul

按照上述方案配制PCR体系（50ul），离心之后进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入热循环，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。取PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上进行电泳。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，4℃储存。

1.2.离心法提取质粒

1.2.1取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应半或更少），12,000g 离心1 min，弃尽上清。

1.2.2.加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

* 确认Buffer S1中已加入RNase A。

1.2.3加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。

* Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO₂中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。

* 此步骤不宜超过5 min。

1.2.4加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000g离心10 min。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。

1.2.5吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000g离心1 min，弃滤液。

1.2.6 将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000g离心1 min，弃滤液。

1.2.7将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000g离心1 min，弃滤液；以同样的方法 再用700 μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

* 两次使用Buffer W2冲洗确保盐份完全清除，消除对酶切反应的影响。1.2.8将制备管置回2 ml离心管中，12,000g离心1 min。

1.2.9将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min。12,000g离心1 min。

* 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。

1.2.10将PCR产物和提取的质粒进行电泳测序分析，确保提取物的准确性。用离心法对扩增后的PCR进行清洁。

1.3酶切体系（60ul）： Buffer(缓冲液) 6ul

Kpn I 3ul

Sal I 3ul

片段 48ul

载体体系（100ul）：Buffer(缓冲液) 10ul

T4 DNA连接酶 2.5ul

Ligase酶2.5ul

载体 85ul

1.4酶连体系（10ul）： 载体 2.5ul

片段 6ul

Buffer(缓冲液) 1ul

T4 DNA连接酶0.5ul

根据上述方案配制酶切体系和载体体系，放入37℃水浴锅中水浴。将酶切体系和载体体系进行清洁，将酶切体系做电泳测序，保证片段的正确性。

2.转化

2.1取100ul冰浴上融化的感受态细胞BL21(DE3)加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴上放置30min。

2.2在42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程中不要晃动离心管。

2.3在每个离心管中加入300ul的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200转/分中培养1小时，待细菌复苏。

2.4吸取一定体积已转化的感受态细胞加到含有抗生素的LB培养基中，将细胞均匀开，将平板置于37℃过夜培养。

LB培养基： 琼脂粉 15g/100ml

Tryptong 10g/100ml

Yeast Extract 5g/100ml

Nacl 10g/100ml

3.表达

3.1从LB培养板上挑取含有重组质粒的转化菌接种到3ml LB培养液(含抗生素)中,37℃过夜培养。

3.2取1ml上述培养基接种于新鲜的LB培养液(含抗生素)，置于37℃继续振摇培养至OD600=0.6时,在冰浴条件下加入IPTG 100ul使其终浓度达到0.5mmol.L^-1，37℃诱导培养18h,离心集菌。

4.功能验证

4.1将18小时培养的菌离心，弃上清液，加入20ml 缓冲液进行细胞破碎化。

4.2将破碎好的细胞进行离心，取上清液放置在冰浴条件下，采用DNS 法进行功能验证: 100 μl酶液加入900μl用20 mM Tris-HCl缓冲液配制的0.2%的琼脂糖溶液，设置对照组，对照组的酶液用蒸馏水代替。45℃下水浴10min。加入1 ml DNS试剂，置于沸水浴10min，待其冷却后，对比两者颜色变化 。

DNS试剂的配置 甲液：将 6.9g 结晶酚溶解于 15.2ml 10%的 NaOH溶液中，用水稀释至 69ml，在此溶液中加入6.9gNaHSO₃，乙液：准确称取 255g 酒石酸钠加到 300ml 10%NaOH 溶液中，再加入 880ml 1% 3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲、乙二液混合，贮存于棕色瓶中室温放置 7～10 天后使用。

5.表达产物的纯化及鉴定

5.1准备Ni柱：将未加入镍的层析柱洗净后，加入1 ml 20%乙醇，全部流出后，加入2.5 ml金属螯合剂Ni琼脂糖，再加入1Ni柱结合缓冲液并没过金属镍，与4℃下竖直放置。

5.2将得到的诱导表达的重组琼胶酶发酵液200ml，在4℃下 12,000 g离心10 min，去掉上清，收集菌体，4℃保存待用。

5.3加入10 ml 1Ni柱结合缓冲液（配方见附录）重悬菌体，将细胞悬液置于冰浴中，用超声波破碎菌体，4℃12,000 g离心10 min，收集上清，沉淀中再加入2 ml 1Ni柱结合缓冲液洗涤沉淀, 4℃12,000 g离心10 min，再次收集上清。将两次离心后得到的上清液用0.22 mm的滤器过滤，待用。

5.4用20 ml 1Ni柱结合缓冲液平衡层析柱。

5.5将过滤后的上清液上柱，流出液重复一次上柱。

5.6用10倍体积（25 ml）的1Ni柱洗涤缓冲液1和1倍体积（5 ml）的1Ni柱洗涤缓冲液2洗涤，收集洗涤液。最后，用1Ni柱洗脱缓冲液洗脱，洗去柱子中剩余的杂蛋白。将收集的样品于4℃待用。

5.7用5ml 30%异丙醇洗涤柱子，全部流出后，加入4 ml 20%乙醇浸没层析柱。

5.8将收集的样品于4℃下在透析袋中用透析液（见附录）透析24 h。透析结束 后于-20℃保存备用。

6.SDS-PAGE

SDS-PAGE分离胶: 无菌水 1.9ml

30% Acrylamicle 1.7ml

15M Tris-Hcl(PH8.8) 1.3ml

10%SDS 0.05ml

10%过硫酸铵0.05ml

TE MED 0.002ml

7.用薄层层析的方法检测水解产物

展开剂：正丁醇：醋酸：水=1:2:1

固定相：预制的硅胶G板。

8. 重组琼脂酶agaWJ2酶学性质的研究

取一定量的酶液，分别检测温度、pH、金属离子对酶活的影响,同时检测酶对温度和pH的稳定性。酶活测定方法：将纯化后的酶液100uL与含0.2%(w/v)琼脂的10mmol.L^-1缓冲液(pH3.0~6.0)为Na₂HPO₄)柠檬酸缓冲体系, pH7.0-8.0为Tris-Hcl缓冲体系,pH9.0~12.0为Gly-NaOH缓冲体系)1mL在设定温度进行反应,水解产生的还原糖采用DNS法测定。酶活力单位定义为:在50℃，pH7.0条件下,每分钟产生1umol还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。

8.1最适pH: 50℃下将酶液分别与不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的反应液混合，测定酶在不同pH反应体系中的活力，观察不同pH对酶反应的影响。

8.2 pH稳定性：在不同pH缓冲液中加入一定量的酶液，50℃下保温30min，测定剩余酶活，观察该酶在不同pH条件下的稳定性。

8.3最适温度:采用pH7.0反应液，在不同温度下（35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）测定酶活，研究温度对酶反应的影响。

8.4温度稳定性：将酶液置于不同温度下保温30min,测定剩余酶活,研究该酶在不同温度下的稳定性。

8.5不同金属离子对酶活性的影响:在pH7.0反应液中分别加入Nacl、Kcl、Fecl₃、Mgcl₂、Cucl₂、Zncl₂、Cacl₂、Mncl₂、SDS、EDTA、Bacl₂、DDT、尿素。45℃下反应5min后测定酶活，研究不同金属离子对酶活性的影响。

1.对比琼脂酶相似基因

2.设计引物PCR扩增得到目的基因片段

3.通过酶切-酶连将基因连入表达载体

4.转化：将重组质粒转入感受态细胞

5.表达：加入IPTG诱导目的基因大量表达

6.用DNS法进行目的基因功能验证

7.纯化蛋白质

8.SDS-PAGE

9.用薄层层析法检测水解产物

10.酶学性质测定

三、可行性分析：在进行该实验之前，对该实验进行了一定的资料及文献查阅，该实验之前有一定可以参考的类似先例，并且自身有一定的实验基础，且该实验项目难度适中，实验所涉及的各项技术在实验室都有完善的设备保障和技术，并且有导师及师兄师姐专业的技术指导，所以十分可行，可以顺利完成。

4. 研究创新点

新琼寡糖是琼脂经琼脂酶水解后形成聚合度为 2~20 的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂粘度高，不溶于水，难以分解利用，新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。随着研究的不断进展和深入，人们逐渐发现新琼寡糖并且具有很多有意义的生理功能特性。新琼寡糖具有抗癌症，抗炎症，抗病毒，抗氧化，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌和美白保湿等生理功能。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景。

目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高，污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。

5. 研究计划与进展

整个毕业课题设计时间安排为：2015年10月-2016年4月

（1）2015.10-2015.11 查阅文献资料，设计试验方案

（2）2015.11-2016.03 实验操作阶段