蜜蜂螺原体吸附相关膜蛋白基因的克隆表达及其对蜜蜂的作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

螺原体(spiroplasma)是一类基本形态为螺旋形原核微生物，属于细菌域(bacteria)，厚壁菌门(firmicutes)，柔膜菌纲(mollicutes)，虫原体目(entomoplasmatale)，螺原体科(spiroplasmataceae)，螺原体属(spiroplasma)。目前发现的螺原体有34个血清组，其中血清组Ⅰ有9个亚组，血清组Ⅷ和ⅩⅥ各有3个亚组，但仅38个种给与拉丁文双名并被详细描述。螺原体主要存在于昆虫体内、植物体内和植物花表面,它和宿主的关系可分为互惠共生(mutualism)、寄生(parasitism）和共栖(commensalism)三种，其中大多数为共栖关系。1976年，在美国maryland州首次发现由spiroplasmamelliferum引起的一种蜜蜂病害螺原体死亡病(spiroplasmosis)；此后，在法国发现由s.apis引起的蜜蜂五月病(maydisease)(clarketal.,1985;mouchesetal.,1983)，这两种病害给蜜蜂养殖造成较大的损失。在国内，陈永萱等于1988年首次从患爬蜂病的蜜蜂体内分离到螺原体菌株ch-1，并对其基本生物学特性作了详细的研究(陈永萱,1988)。

迄今为止，致病螺原体已报到过多种，其基本生物学特性也有详细研究，但致病机制方面的研究仍然很少，通过测定的我国寄生蜜蜂引起爬蜂病的主要病原spiroplasmamelliferumch-1基因组草图，并与已发表的螺原体菌株spiroplasmadiminutumcuas-1、spiroplasmataiwanensect-1、spiroplasmamelliferumipmb4a、spiroplasma.citrigii3-3x、spiroplasma.melliferumkc3基因组序列比对，推测蜜蜂螺原体中可能存在的几种致病因子，例如粘附相关蛋白基因arp-1、arp-2，几丁质酶基因、几丁质脱乙酰基酶基因、信号识别颗粒p54蛋白基因等，但这些因子在致病过程中的确切作用有待进一步研究。

螺原体是一类非常重要的微生物资源,在系统发育分析上属革兰氏阳性菌，具有滤过性，能独立生活和自我复制。基因组780-2200kbp，基因组最小的菌株为spiroplasmaplatuhelixpals-1(carleetal.,1995)，最大的菌株为spiroplasmaixodetisy32t(williamsonetal.,1997)。由于缺乏细胞壁,基因组很小,结构比较简单,形态具有多样性,生物合成与代谢能力有限等特点,非常适合作为细胞生物学基础问题的研究模型,如生物膜和细胞运动的研究模型、调查螺原体在自然界中的分布、螺原体的宿主类型等，研究螺原体与其他生物体的相互关系将有助于人们充分地认识和利用这类重要的生物资源。因为螺原体的存在与其宿主有着密切的联系,并且含有大量的蛋白质，所以可以通过研究螺原体上的膜蛋白（一种相关吸附蛋白）方面，来探究螺原体对生物体正常细胞的侵染机制。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标及内容

螺原体ch-1609基因的突变、克隆表达，以及运用生物信息学对其进行分析。

可能存在的问题及解决方案

3. 研究的方法与方案

主要研究内容

1、s.melliferumch-1的sarp-609基因的生物信息学分析

在线软件（expasyprotparam、swiss-port、trembl等）分析s.melliferumch-1sarp-609基因的一级结构、二级结构和三级结构和理化性质。

4. 研究创新点

对PCR引物进行自主设计，使用不同生物信息学的分析软件来对蛋白质的各种特性、结构进行分析。

5. 研究计划与进展

1.sarp-609基因成功完成点突变。

2.成功构建重组质粒pet28a-609。

3.通过重组质粒，运用表达菌株成功表达出sarp-609蛋白，并成功通过离子交换层析纯化蛋白。