群感信号AI-2对根际促生解淀粉芽孢杆菌SQR9的成膜和运动性影响的分子机理研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

研究意义

植物根际促生细菌是一类能在植物根际存活定殖并具有促进植物生长或防控土传病害能力的一类有益微生物。近年来，pgrp菌株因其环境友好、安全无毒等优点在农业生产中得到广泛的应用，在促进作物生长及防控土传病害等方面取得了良好的效果。施用微生物肥料是实现我国化肥减施、促进农业可持续发展的有效途径。一般常用的pgpr菌株包括bacillus spp.，streptomyces spp.，pseudomonas spp.和burkholderia spp.等。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

（1）确定ai-2对sqr9菌株生物膜形成和细胞运动性的影响。

（2）探明ai-2信号对sqr9菌株在根际原位成膜定殖的影响及其浓度效应。

3. 研究的方法与方案

研究方法

（1）SQR9与生物膜形成相关特性的检测

胞外多糖EPS的测定：

蒽酮-硫酸法测定，步骤是：加0.4 ml合适浓度的EPS溶液到干净的10 ml的玻璃试管，然后添加0.1ml新鲜的2%蒽酮（溶解于乙酸乙酯），慢慢滴加1ml98%浓硫酸，封口膜封住试管口让反应至少10分钟，转移1 ml反应产物到比色杯中测定OD₆₂₀.设置标准曲线：添加葡糖糖10,20,30,40,50,60,80g/ml。

菌株 SQR9的运动性实验：

Swimming:将过夜培养的细胞（添加信号分子和不添加信号分子的对照）接种至新鲜的培养基中，当OD₆₀₀≈1，用牙签尖部接种菌液到细菌运动性实验培养平板(1% tryptone, 0.25 % NaCl and 0.3 % of agar)，在12小时或更长时间后定所形成的光环的直径。

Swarming:将过夜培养的细胞（添加信号分子和不添加信号分子的对照）

接种至新鲜的培养基中，当OD₆₀₀≈1，用枪头吸取 1-2 L菌液接种到细菌运动性实验培养平板(LB培养基：0.5%(wt/vol)glucose and 0.6%(wt/vol))，在24小时或更长时间后观察并测定菌落直径或拍照。

SQR9及突变体的绿色荧光蛋白（GFP）标记

将张瑞福老师实验室构建的能持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的大肠-枯草杆菌穿梭质粒pHAPII通过电转化方法转入SQR9及突变体菌株，涂布于含 20 μgml^-1卡那霉素的LB平板，选取在荧光显微镜下可发出绿色荧光的菌落

（2）SQR9及其突变株的根际定殖分析：

AI-2对SQR9菌株在黄瓜根际原位的成膜定殖实验将采用根系无菌培养体系和激光共聚焦扫描显微观察技术，定性定量分析菌株SQR9在根际的定殖。

SQR9及其突变体的菌悬液在LB液体中培养至对数生长中期（OD₆₀₀=1.0-1.2），离心收集菌体，用M8缓冲液洗涤2次，最后重悬于适量M8缓冲液至菌体浓度为 OD₆₀₀=0.2，将洗净的黄瓜根系浸没在重悬的菌悬液中，25℃静置2 min，或接种至营养液中使菌体浓度达到108cfuml^-1。接种后采集根系样品，利用激光共聚焦荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）标记的菌株SQR9及突变体在作物根表的定殖和生物膜形成情况，同时采集作物根系样品，利用稀释涂布计数法（结合卡那霉素筛选和绿色荧光筛选）和定量PCR法（以绿色荧光蛋白基因gfp为靶基因设计的特异引物，序列为F：5′-CTACTTTCGGTTATGGTGTT-3，R：5′- GTCTTGTAGTTCCCGTCATC-3，及在SQR9特异基因位点上设计的引物，序列为 F：5′-CATGAGATGGCGGGCTTT-3，R：5′- CGCATCCTCCCTGTCTTTG-3′定量检测根表的SQR9及突变体数量。

实验室

胞外多糖EPS测定

swimming运动性

swarming运动性

可行性分析

（1） 研究方法的可行性

本课题应用的试验方法，如多糖测定的蒽酮-硫酸法、运动性实验、GFP标记、根际定殖实验等，这些技术已在本实验室和相关实验室得到较广泛的应用。

（2） 实验条件的可行性

本课题结合本实验与资源与环境学院张瑞福教授实验室有良好的实验条件和实验仪器设备。

（3） 研究人员的可行性

经过大学四年的学习与积累已较好地掌握了微生物学，分子生物学等相关实验操作，并且还有师长前辈的耐心指导。

4. 研究创新点

（1） 探明AI-2信号对菌株SQR9的生物膜形成和运动性影响的具体表现是本课题的创新之处。

（2） 评估AI-2群感信号对根际促生菌SQR9（微生物肥料）根际原位成膜定殖的影响和浓度效应也是本课题的创新之处。

5. 研究计划与进展

研究计划

第一个月：完成luxs突变株与生物膜形成相关的特性的测定。

第二、第三个月：对sqr9及luxs突变株进行gfp标记；将sqr9及其luxs突变株进行根际定殖实验探明其影响sqr9菌株成膜定殖的具体表现。