灵芝DNA甲基化对灵芝三萜生物合成的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题意义：灵芝为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌，是我国名贵的药用真菌之一。

具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。

近年来，灵芝得到东南亚国家以及美国和加拿大许多学者的深入研究。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标通过5-氮杂胞苷处理下灵芝三萜、ros（活性氧）及ca2 含量的差异，探究灵芝dna甲基化与灵芝三萜含量变化的关系，进一步从表观遗传学角度解释影响次生代谢产物灵芝三萜生物合成的分子机制。

2．研究内容2.15-aza处理下灵芝细胞生长和灵芝三萜合成的变化采用摇床培养法培养液体菌种。

液体培养基培养灵芝，添加不同浓度的5-aza，来测定灵芝三萜含量的变化。

3. 研究的方法与方案

研究方法1 灵芝三萜含量测定方法(1) 取100 mg 60℃烘干菌丝粉,精确记录重量,置于10 ml离心管中,加入3 ml的95%乙醇,提取灵芝三萜一周(2次),转移至50 ml离心管(2) 8000 g离心10 min,上清转移至新50 ml离心管,50℃真空干燥;(3) 用3ml水溶解,再用3ml氯仿抽提,转移氯仿相,加饱和nahco3溶液;(4) 转移上层nahco3相，缓慢加入2mol/l的hcl,使ph低于3.0;(5) 氯仿抽提,转移至新管,40℃蒸干,加3ml甲醇溶解,测定a245值;(6) 利用标准曲线或回归方程求出样品三萜含量。

2ros含量及ca2 离子检测采用平板培养插片观察菌丝形态及分叉，采用ca离子探针孵育和nbt染色分别观察菌丝ca离子含量和ros产生量。

建立其与ca2 及ros的联系。

4. 研究创新点

特色或创新之处本实验首次在灵芝这类大型丝状真菌中研究控制灵芝三萜含量变化的表观遗传机制，探究DNA甲基化对灵芝生长及次生代谢的影响。

5. 研究计划与进展

1.研究计划1) 2015.9-11 查阅资料，整理实验思路，准备实验器材2) 2015.11-2016.01 初步研究甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理下对灵芝生长及三萜的影响，分析结果，总结经验3) 2016.02-2016.03实验确认处理条件下灵芝ca2 含量及ros的变化。

4) 2016.03-2016.04 构建dnmt1同源基因的沉默表达载体5) 2016.04-2016.05 处理分析实验数据方差分析，f因子测验，多重比较分析，写毕业论文（设计）。

2. 预期进展1) 确定在甲基化抑制剂处理下灵芝三萜含量变化2) 初步探究dna甲基化对灵芝次生代谢ros及ca2 含量的影响。