茶叶来源的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达及活性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病, 由于发现肿瘤时大部分已到达中或晚期，现阶段大多数患者的治疗效果非常不理想。

故而早期发现和诊断对提高恶性肿瘤治疗效果必不可少。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员作为一种肿瘤标志物, 对于组织细胞具有重要的调节与保护功能, 对于肿瘤的生长、浸润和转移起重要作用, 同时在肿瘤的诊断和预后方面也有意义[1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本课题旨在探索出茶树来源的蛋白酶抑制剂的抑制剂活性。

研究内容：1.茶树来源蛋白酶抑制剂基因的获得2.半胱氨酸蛋白酶抑制剂的体外大量表达3.目的蛋白的分离纯化4.半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性研究关键问题：拟解决的关键问题在于茶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达系统的构建以及其抑制常数的测定。

3. 研究的方法与方案

研究方法：从茶叶中提取蛋白酶抑制剂基因并构建重组质粒m-pet-32a，表达菌株后对融合表达菌株进行iptg诱导，随后低温离心进行简单的分离，后对菌体进行超声破碎、透析以及his-tag融合蛋白亲和层析对目标蛋白进行进一步的分离纯化。

最终用木瓜蛋白酶及其发色底物对其抑制活性进行探究。

技术路线（详见附件）： 实验方案：1.融合表达菌株的诱导及菌体收集100ug/ml ampicillin 液体lb培养基培养的重组m-pet-32a质粒转化菌株,37℃ 200rmp 12h以上至od600=0.6.作为转接种子。

4. 研究创新点

1、构建茶叶蛋白酶抑制剂的原核表达系统，通过一系列的分离纯化手段获得了成熟的小肽。

2、利用木瓜蛋白酶及其发色底物，对获得的小肽进行蛋白酶抑制剂活性的测定，可获得Ki进而判断其抑制类型。

5. 研究计划与进展

研究计划： 2015.9~2015.10:查阅资料，进入实验室学习相关实验技能。

2015.10~2015.11初步进行实验探索，撰写实验开题报告。

2015.11~2016.1正式实验 2016.3~2016.4完成全部实验 2016.5撰写实验论文预期进展 ：1.探索与学习技能阶段，完成蛋白酶抑制剂基因的获得。