1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义
赤霉素是植物生长发育过程的必需激素之一，其能够调控植物生长发育的多种生理过程[1,2]。葡萄是赤霉素高度敏感性果树，赤霉素在葡萄花和果实发育中的作用非常典型，其能够抑制葡萄花的发育，延迟开花；诱导葡萄花粉败育促进单性结实产生无籽果实[3,4]；改变果穗的穗形；促进葡萄细胞伸长分裂、促进果实膨大[5,6]；疏花疏果、改善果实品质；促进坐果与果实早熟[7-9]；影响果实糖分积累与果实色泽等[10-15]。尽管如此，但赤霉素调控葡萄花果发育过程的分子机理尚不完全清楚[16]。模式植物的研究发现，转录因子gamyb是赤霉素信号途径的正向作用因子，也是mir159的靶基因[17-19]。mir159通过响应赤霉素信号介导靶基因gamyb裂解在植物花药的发育及其育性形成中起着重要作用[20,21]。过量表达mir159 能够抑制植物花药发育导致花药育性降低。拟南芥gamyb能够负调控leafy基因的表达[22]，从而影响拟南芥开花时间。另有报道表明，mir159及其靶基因gamyb参与植物种子萌发过程的调控。草莓mir159及其靶基因gamyb不仅在雄蕊中高表达，而且在幼果、白果及转色期果实中均有高水平的表达[23]。众多研究表明，mir159及其靶基因gamyb可能参与调控植物发育的多种生理过程。但是，在葡萄方面，mir159及其靶基因gamyb方面的相关研究仍未见报道。
国内外研究概况
2. 研究的基本内容和问题
1.1研究目标
初步阐释mir159及其靶基因gamyb响应赤霉素信号调控葡萄花、果发育的作用，以及它们调控葡萄开花的机制。
1.2研究内容
3. 研究的方法与方案
2.1研究方法
（1）葡萄实验材料选择与处理
基于我们前期的研究基础及开展相关研究工作的需要，本研究拟以高产、优质、抗病的欧美杂种四倍体藤稔葡萄为研究试材。依据生产经验结合品种特性，于花前7天利用40ppm GA浸蘸花序，分别在处理后1、3、5、7（开花）天，动态采集花序（花）的处理与对照样品，并于花后15、30、45天采集处理与对照的果实样品，且为了保证样品的代表性，每次需要从多个不同部位采取适量样品，以保证样品的代表性，采集后样品放入液氮速冻，带回实验室-70℃保存备用。
（2）葡萄花果赤霉素处理与对照的RNA的提取以及cDNA的合成
本研究拟采用本实验室改良后的RNA提取方法提取所采集的果实与花的样品（Wang et al. 2011, PLoS ONE, 6(7) e21259）。然后使用Takara生物试剂公司生产的M-MLV试剂盒，步骤参考其说明书。（参照王晨等，2010）
（3）引物设计
利用Primer 3软件，设计GAMYB,159a、159b、159c，和LEAFY等基因引物，其中miR159a/b/c是miR159a/b/c的前体基因，见表4[]。
表4 引物序列
Table 4 Primer sequence
引物名称 | 引物序列 | 引物长度 |
LEAFY-F | GGACGACATGAACAGCC | 17 |
LEAFY-R | ATCCCCACCTTCGTTGTCAT | 20 |
GAMYB-F | CAAAGGACCAAGCCATGATG | 20 |
GAMYB-R | CTTATGCTTCCCAATGGCCC | 20 |
159c-F | GGGTTTATGGGAGCTCCTTTA | 21 |
159c-R | GAAGGGTTATGAGAGCTCCCTT | 22 |
159c-F | GAAGATCTGGGCTTGTGGGAGCTTCTTTA | 29 |
159c-R | GGACTAGTGATCGGTTATGAGAGCTCCCTTC | 31 |
159c-F | GAGTGGAGCTCCTTGAAGTCCA | 22 |
159c-R | GTGTAGAGCTCCCTTCAATCCAAA | 24 |
（4）miR159与GAMYB基因的半定量RT-PCR表达
以（2）中反转录的cDNA为模板，利用（3）中合成的引物进行不同基因的半定量RT-PCR表达分析。
2.2技术路线（见附件）
2.3可行性分析
（1）研究内容的可行性
模式植物拟南芥、水稻中有关响应赤霉素信号与其它激素信号的miRNA分子调控机理研究，为本项目的开展提供了重要的参考依据，尤其是响应赤霉素的miRNA在拟南芥花发育、开花时间及花药育性等方面的调控机制研究为本项目的开展提供重要借鉴；申请人对响应赤霉素miRNA的初步研究表明葡萄中确实存在响应赤霉素的miRNA。这些研究从内容方面为本研究的开展提供了可行性依据。
（2）研究材料的可行性
研究发现，欧美杂种的四倍体藤稔葡萄对赤霉素处理比较敏感，若在花前三天处理花序无核率可达到98，果粒达到了正常有核果的大小、果实的品质及风味明显优于对照，表明赤霉素处理对藤稔果实发育的多种生理过程（无核、果实膨大、糖分积累、果皮色泽等方面）具有重要的影响。本项目以藤稔葡萄为研究试材，开展葡萄花果响应赤霉素miRNA的挖掘及其参与果实发育的生物学调控通路的识别，项目可行性和预期成果实现的可能性高。
（3）研究条件有保障
导师所在研究室具有齐全的分子生物学研究实验仪器与设备如核酸分析仪、蛋白分析仪、冷冻离心机、PCR仪、多功能电泳仪、凝胶成像系统、荧光定量实时PCR仪，电激转化细胞融合仪以及培养箱、超低温冰箱，还有设施完好的组培室、日光温室，且具有完备的培养及保存材料的条件。此外，导师课题组与江苏省农业科学研究院葡萄生产基地有多年的合作关系，实验材料有保证。
4. 研究创新点
赤霉素在葡萄生产上的应用极大地提高了葡萄产业的经济效益，目前已成为葡萄生产栽培技术的一个重要组成部分。本研究特色之处在于：
mirna是近年来新发现的能够参与激素信号转导调控植物生长发育的重要调节因子，并且响应赤霉素mirna的研究颇少，葡萄乃至果树方面尚无相关报道；
另一方面，在葡萄方面，mir159及其靶基因gamyb方面的相关研究仍未见报道。
5. 研究计划与进展
研究计划
2015.03-2015.06
1）开展实验的准备工作，主要是所需试剂盒、易耗品的购置；
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