瑞士乳杆菌MB2-1 S层蛋白结构解析及其生理活性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

瑞士乳杆菌mb2-1是由南农食品院的教师团队通过研究传统的赛里木酸奶从中分离得到的。是一种高产黏的乳酸菌。乳酸菌存在于人类与大多数动物的肠道之中，具有预防肠道感染的作用，并且能促进人体健康。人们一般认为，乳酸菌之所以能够抑制致病菌是因为粘附到小肠上皮细胞是致病菌感染的重要环节，而它拥有能竞争性抑制致病菌受体结合位点的重要机制。其中s-层蛋白也是影响乳酸菌与宿主组织粘附作用的主要因素之一。瑞士乳杆菌mb2-1s层蛋白具有粘附性，可以用其来改善药物载体等，使药物在人体内能停留更长时间，使药物被人体充分吸收提高使用效率。

生物被膜是由附着于惰性或活性实体表面的细菌细胞以及由其自身分泌的含水聚合性基质包裹所形成的被膜状细菌群落，也被称为细菌生物膜，具有对抗生素高度不敏感的特性。通过研究大家普遍认为，生物被膜是使得感染难以治愈以及引起慢性持续性的感染的重要因素。目前为止抗生素等抗菌药物的使用仍然是控制生物膜感染的重要手段，但是长时间的使用会使细菌产生耐药性使得抗菌药物使用效果越来越差。如果s层蛋白具有抗生物膜活性，那么利用s层蛋白来控制生物膜感染将成为一个全新的并且相对来说安全环保的手段。对医药食品领域避免微生物生物膜的干预以及清除有着显著地帮助。

在国内李振梅等研究了嗜酸乳酸杆菌(l.acidophilus)的s层蛋白的提取，他们采用了5m(ph=2)的氯化锂溶液、5m(ph=7)的氯化锂溶液以及8m的尿素来进行s层蛋白的提取。在国外p.mobili等就用5m氯化锂溶液提取四株开菲尔乳酸菌(l.kefir)的s层蛋白。他们都研究了s层蛋白的结构特征。

2. 研究的基本内容和问题

本课题首先研究的是采取不同方法提取瑞士乳杆菌mb2-1的s层蛋白并比较提取效果。比较提取效果是采用sds-page凝胶电泳的方法来验证的。选取一种最佳提取方法后，通过不断的试验改进，进一步提高提取效果。从而得到大量的并且纯度较高的s层蛋白。由于蛋白是分批得到，所以我采用冷冻干燥的方法得到蛋白冻干样之后将其保存在-20℃环境下。得到足够量的高纯度的s层蛋白是非常关键的。

在存够样品之后，进行蛋白质谱分析和氨基酸自动分析来研究蛋白质的分子量以及其氨基酸组成成分。

然后利用s层蛋白样品进行抗菌抗生物膜活性相关的研究。主要是为了验证瑞士乳杆菌mb2-1s层蛋白是否抗菌抗生物膜活性，是否可以被利用作为食品医药方面避免甚至是消除生物膜干预的新产品。抗生物膜实验主要是采用的96孔板法，该方法较为简单但是要注意，由于采用的是大肠杆菌，铜绿假单胞菌以及鼠伤寒沙门氏菌这几种致病菌所以需要在培养过程中要与其他菌分离，同时培养时使用的用具要湿热灭菌。在做该实验室要注意使用的s层蛋白需要无菌。

3. 研究的方法与方案

对于提取瑞士乳杆菌mb2-1s层蛋白本课题主要是采用氯化锂、盐酸胍、sds三种试剂进行比较。首先活化菌种，发酵过后一次离心取沉淀分别加入三种试剂反应，然后二次离心取上清液，透析过后浓缩，通过进行sds-page凝胶电泳分析不同方法的提取效果。该方法与所采用的试剂以及方法是在国内外的文献中查阅所得，所以可行性十分高。在查阅文献后确定乳酸菌s层蛋白分子量25-71kd之间，所以在跑电泳时采用20-150kb的蛋白marker。

使用氨基酸自动分析仪能完成游离以及水解蛋白氨基酸的分析，本课题中所检测的是水解后的蛋白。蛋白质谱分析采用的是南农肉品楼便可以完成氨基酸自动分析，而且前处理方法在我们能力范围之内，蛋白质打质谱采用的是maldi-tof在食品院内便可以完成，而且瑞士乳杆菌mb2-1的s层蛋白分子量在其测量范围之内。所以这两方面可行性较高。

关于抗生物膜活性的实验，本课题主要是针对大肠杆菌，铜绿假单胞菌以及鼠伤寒沙门氏菌这三种致病菌进行研究，采用的是96孔板法，在96孔细胞板中培养过后采用结晶紫染色，然后使用全功能酶标仪检测570nm下的吸光度，从而得出实验结果。该方法并不复杂，操作要求也不高材料也比较容易获得，而且该方法在国内很多研究抗生物膜活性实验中都被采用，经证明有较大的可行性。

4. 研究创新点

本课题围绕着瑞士乳杆菌mb2-1的s层蛋白进行研究，与研究比较多的多糖相比对s层蛋白这方面的研究比较少，而且实验所采用的菌种为南京农业大学食品院李伟老师团队从新疆赛里木酸奶中提出，是乳酸菌的一种，呈长杆状，无鞭毛和芽孢。形成的菌落为圆形呈乳白色，边缘整齐。耐酸，生长温度为40℃左右。但与普通的乳酸菌相比该菌种发酵后的酸奶更加粘稠而且能拉丝。

本课题中所研究的s层蛋白抗生物膜活性以及海藻酸钙对s层蛋白的吸附性这两方面对于现如今的食品以及医药行业存在很大的帮助。

大家普遍认为，生物被膜是使得感染难以治愈以及引起慢性持续性的感染的重要因素。目前为止抗生素等抗菌药物的使用仍然是控制生物膜感染的重要手段，但是长时间的使用会使细菌产生耐药性，随着耐药性的增加，使得它们有一定的可能性产生细菌生物膜，而生物膜一旦产生那么该类抗菌药物即使再使用成百倍的剂量都没有什么用了。所以如果实验证明s层蛋白能抗生物膜活性，那么将会是一种有效地避免甚至是减少生物膜产生的方法。而且该方法更为环保有效。

5. 研究计划与进展

由于研究课题为研究瑞士乳杆菌mb2-1s层蛋白，所以最先展开也是最为重要的是就是提取s层蛋白。而提取s层蛋白还分为两部分，首先需要比较不同方法提取s层蛋白的效率，分别用氯化锂，盐酸胍以及sds三种试剂来提取，其中同种试剂还采用不同浓度来实验，每次提取过后需要透析、浓缩、跑电泳以及冻干。电泳为sds-page凝胶电泳。在选取了最佳方案之后，按该方案进行s层蛋白的大量提取。

保存足够的s层蛋白冻干样之后，进行氨基酸自动分析以及蛋白质质谱分析（maldi-tof）。

然后用96孔板法完成抗生物膜活性的实验，主要培养大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及铜绿假单胞菌这三种致病菌。完成后用全能酶标仪检测570nm下的吸光度。