葡萄ASR基因功能的研究与分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：脱落酸、 胁迫、 成熟蛋白（abscisic acid stressripening proteins， asr）是 一 类 植物特异性小分子量亲水性蛋白家族， 其组氨酸、 谷氨酸及赖氨酸含量很高。

aba调控植物的生长及对逆境胁迫产生应答，而asr基因与植物抗逆有关。

葡萄（vitis vinifera l.）是一世界性水果，其营养价值很好，更值一提的是具有特别好的抗氧化作用。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：（1）确认葡萄中的asr基因具有生物学功能及其对aba和糖的应答模式；（2）确定asr基因在葡萄组织中的表达模式；（3）操纵asr基因的表达对葡萄果实发育成熟产生影响的生理及分子机理；内容：（1）葡萄中 asr 基因的克隆及生物学分析为了分析 asr 基因在葡萄中的拷贝数，提取葡萄果实的总 dna，利用 southern blot 杂交技术对其进行分析；为了分析vvmsa基因对糖和aba的应答模式，利用圆片温育实验分析糖、aba、aba 抑制剂去甲二氢化愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid，ndga）对vvmsa基因表达的影响；为了分析糖对vvmsa基因表达的影响是依赖aba路径还是非依赖aba路径，利用圆片温育实验分析（糖 ndga），对vvmsa基因表达量的影响；（2）葡萄中 asr 时空表达模式为了分析vvmsa在草莓各个组织中的表达模式，根据果实大小、硬度和色泽把草莓果实发育时期分成六个，进行拍照。

六个时期的果实分别为幼果期；小果期；中果期；大果期；转色期，提取六个时期的总 rna 以及各个组织根、茎、叶、花的总 rna，进行反转成 cdna，利用 real-timepcr 和 northern blot 杂交技术来分析 asr ；（3）asr 基因在葡萄果实成熟中的功能分析为了分析vvmsa对草莓果实发育成熟的影响，构建vvmsa超表达和干扰载体，通过农杆菌介导的基因瞬时表达体系对vvmsa在葡萄果实中的表达进行调控，进而分析果实的生理及分子参数。

对于vvmsa干扰载体的构建，在vvmsa基因的保守区扩增一段600bp左右的片段，通过酶切连接转化等分子生物技术构建于烟草脆裂病毒载体ptrv2的多克隆位点用于vvmsa基因的干扰（rna interfere, rnai）；同样对于vvmsa超表达载体构建，扩增vvmsa转录因子的cds区，构建于植物双元表达载体pbi121中用于vvmsa基因的超表达（over-expression, oe），利用液氮冻融法转化农杆菌gv3101用于侵染果实。

3. 研究的方法与方案

研究方法与技术路线：（1）asr 的组织表达模式及基因拷贝数分析提取葡萄同一植株的根、茎、叶、花和划分的6个果实发育时期的幼果期；小果期；中果期；大果期；转色期；成熟期的总 rna，利用 northern blot 杂交和 real-time pcr 荧光定量来分析 vvmsa基因的表达量。

提取葡萄绿果的总 dna，利用 southern blot 杂交来分析 vvmsa基因在草莓中的拷贝数；（2）aba 和糖对 vvmsa基因的影响通过葡萄果实三种主要可溶性糖蔗糖、葡萄糖和果糖处理葡萄果实，分析糖对vvmsa基因的转录水平的影响，aba 糖，分析aba和糖协同调控vvmsa基因的转录水平，糖 aba抑制剂（ndga），分析糖调控vvmsa基因的转录是依赖 aba 路径还是非依赖 aba 路径；（3）vvmsa基因的表达对葡萄果实发育的影响克隆vvmsa基因600bp的特性序列，构建到ptrv载体上，用于基因的干扰，vvmsa基 因 的 cds 序 列 构 建 到 pbi121 上 ， 用 于 基 因 的 超 表 达（over-expression, oe），同时设置空载体作为对照。

通过农杆菌介导侵染葡萄果实，定期观察葡萄果实表型变化。

4. 研究创新点

特色或创新之处：（1）通过调控ASR基因在葡萄果实中的表达，及生理和分子指标的测定，分析葡萄果实的发育成熟机理，同时为有效利用重要基因调控果实发育提供科学依据；（2）为葡萄中基因功能的鉴定提供平台。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展2015.1-2015.2确定毕业设计的研究方向2015.2-2015.4查阅相关文献，明确后期实验任务2015.4中旬开展实验的准备工作，所需试剂盒、易耗品的购置；2015.6下旬试验样品采集，提取葡萄总 RNA 进行反转；葡萄果实中分离 ASR 基因 利用 Northern blot 分析 ASR 基因在葡萄果实和各个组织中的表达量； 利用农杆菌介导体系对绿果时期的葡萄果实进行侵染2015.9-2015.12分析葡萄ASR 基因表达量变化后蔗糖、葡萄糖、果糖和 ABA 含量的变化；分析葡萄ASR 基因瞬时超表达和干扰后果实硬度、色泽、可溶性固形物、香味等物质含量的变化2016.1 整理数据，得出结论2016.2-2016.4论文的撰写