菊花淹水响应基因CmRAP2.3的克隆与功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 引言 菊花(chrysanthemum morifolium)作为我国十大传统名花之一，具有悠久的栽培历史，自古以来深受我国以及世界人民的喜爱。

在我国，本土菊花品种至少有3000种[1]，花型、花色和株型等的种质资源非常丰富，具有极高的观赏价值和园林运用价值。

菊花生性强健，适应性强，但是耐涝性差，尤其在炎热的夏季，雨后的积水常常造成菊花大面积死亡[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标（1）克隆cmrap2.3基因片段（2）研究淹水响应基因cmrap2.3的功能2、研究内容供试材料为南农雪峰，其耐涝性状优良，在菊花耐涝性鉴定与评价中表现出色，对研究菊花耐涝性具有重要意义。

(1)通过实验室已得到的cmrap2.3基因设计pcr引物，克隆与淹水响应的转录表达的相关基因。

(2)研究筛查cmrap2.3基因的功能： a)亚细胞定位 b)转录激活活性 c)基因表达模式分析3、拟解决的关键问题 菊花淹水响应基因的基础研究是深入探讨菊花耐涝机制、解决菊花水涝胁迫以及培育耐涝性菊花新品种的关键性问题。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法（1）cmrap2.3基因克隆： a)rna提取 b)反转录获取cdna c)高保真pcr扩增（2）基因功能研究： a)亚细胞定位 b)酵母单杂进行转录激活活性测定 c)荧光定量pcr(rtpcr)（3）构建基因表达载体： a)基因工程技术 b)gateway技术2、技术路线cmrap2.3基因克隆rna提取反转录获取cdna高保真pcr扩增构建基因表达载体；cmrap2.3基因功能亚细胞定位gfp表达检测构建基因表达载体；cmrap2.3基因功能转录活性测定酵母单杂构建基因表达载体；cmrap2.3基因功能表达模式分析荧光定量pcr构建基因表达载体3、实验方案（1）目标基因的筛选 选取待试材料的幼嫩叶片，根据盐酸胍法采取trizol试剂盒提取材料的总rna，待提取后进行电泳检测，并将其于80℃保存；使用两步法对rna进行反转录，获取第一链cdna；以第一链cdna为模板，根据已知的淹水响应基因cmrap2.3的基因设计引物，运用高保真pcr扩增以确定序列的可靠性；反应结束后将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取特异性条带进行切胶纯化。

（2）运用生物信息学软件对目标基因进行分析运用blast程序对基因序列进行同源性分析，以确定目标基因与其他物种的erf家族成员的同源性；运用mega软件将cmrap2.3基因与其他物种的erf家族成员进行比对，构建系统进化树。

（3）确定目标基因的表达模式提取待试材料的rna并进行反转录，运用rtpcr技术，对内标基因和目标基因进行扩增，通过检测ct值比较目标基因表达水平的差异性或动态变化。

4. 研究创新点

目前，对于erf亚族的其他反式作用因子对于基因的过量表达或抑制表达的机制研究得比较深入，例如水稻osderf1基因对干旱的响应、拟南芥rap2.2基因对低氧胁迫的反应等。

然而对菊花淹水响应的相关基因却鲜有报道。

本课题通过定量分析与淹水响应的相关基因，以明确其在淹水胁迫的逆境下的基因表达与调控功能，为将来培育耐涝性状优良的菊花新品种提供基因背景以及奠定理论基础。

5. 研究计划与进展

1、2016.052016.08，初步获取目标基因。

2、2016.092016.12，完成目标基因的功能分析，包括亚细胞定位、转录激活活性分析以及表达模式分析。

3、2017.012017.02，利用生物信息学软件对目标基因进行分析。