萝卜花青素合成代谢关键基因的分离克隆与表达特征开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

萝卜(raphanus sativusl.)是十字花科、萝卜属一、二年生草本植物。其原产于中国，适应性强，营养价值高，现已成为全球广泛栽培的具有重要经济价值的蔬菜。萝卜的肉质根是其主要食用部位，肉质根的颜色有很多种，如：绿皮红肉、绿皮白肉、白皮白肉、红皮红肉、红皮白肉红心等，这主要与萝卜中积累了大量的花青素有关。

花青素（anthocyanin）是一类广泛存在于植物体内的水溶性天然色素，属于类黄酮化合物。现已知的花青素有20种^[1]，其中在植物中常见的有6种，即天竺葵色素(pelargonidin)、矢车菊色素(cyanidin)、飞燕草色素(delphindin)、芍药色素(peonidin)、牵牛花色素(petunidin)和锦葵色素(malvidin)。花青素有助于植物授粉和种子传播。已有研究表明，天然花青素对提高植物抗胁迫能力有重要作用^[2][3]。除此之外，花青素还有重要的营养和保健功能，有助于预防心脑血管疾病、护肝、抗癌等^[4][5]。因此，开发高花青素含量的萝卜新品种，具有广阔的应用前景和重要的研究意义。

提高萝卜中花青素的含量，首先要了解植物中花青素的生物合成机制。花青素生物合成途径是植物类黄酮途径的一个分支，苯丙氨酸是花青素和其它类黄酮物质生物合成的直接前体，花青素是在细胞质中由苯丙氨酸经一系列的酶促反应合成的。由苯丙氨酸到花青素的合成路径被划分为三个阶段。第一个阶段由苯丙氨酸到4-香豆酰coa，这一过程在苯丙氨酸裂解酶（pal）、肉桂酸羟化酶（c4h）、4-香豆酰coa连接酶（4cl）基因调控下完成，是许多植物次生代谢共有的路径^[1]。第二阶段由4-香豆酰coa和丙二酰coa到二氢黄酮醇，这一过程在查尔酮合成酶（chs）、查尔酮构酶（chi）、黄烷酮-3-羟化酶（f3h）催化下完成；第三阶段，二氢黄酮醇在类黄酮-3'-羟化酶（f3'h）和类黄酮3',5'-羟化酶（f3'5'h）催化下生成双氢槲皮素和二氢杨梅黄酮，它们在二羟黄酮醇-4-还原酶（dfr）的催化下生成无色花青素，经花色素合成酶(ans)合成有色的花色素^[6]。经过这三个阶段，花青素的基本碳骨架形成，之后还要对其进行糖基化和甲基化修饰。修饰过程由花色苷3－葡糖基转移酶（3gt）、花色苷5－葡糖基转移酶（5gt）和甲基转移酶（mt）催化。花青素经过糖基化和甲基化修饰后，转运到液泡中进行储存。目前有关花青素运输与液泡聚集方面的机理尚不十分清楚，已有研究表明，谷胱甘肽s－转移酶（gst）^[7][8]及液泡中的花青素内涵体（avi）^[9][10]与花青素的转移有关。现在，已克隆鉴定出植物中一些调控谷胱甘肽s－转移酶（gst）的基因，如：拟南芥里的tt19 基因(编码typeⅠgst）^[11]，玉米里的bronze-2基因（编码typeⅢgst）^[12]，矮牵牛里的an9 基因（编码typeⅠgst）^[13][14]等，这些基因都来自gst基因家族。gst在拟南芥、玉米等多种植物中研究已较为深入，但在萝卜中其结构和功能特性的相关研究还鲜有报道。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标:

本研究以四个品种的萝卜为研究对象，通过测定其不同发育阶段不同组织中花青素的含量，分析花青素合成相关基因和转录因子在不同萝卜品种的不同发育阶段以及不同组织中的表达情况。通过对萝卜中调控花青素生物合成的结构基因和转录因子进行分离克隆和序列表达分析，探究萝卜中花青素合成、转运的分子机制。为阐明萝卜中花青素的生物合成与基因表达的关系，选育高花青素含量的萝卜品种提供理论依据。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

1.研究方法：

1.1实验材料

本实验采用四个萝卜品种：nau-yh、nau-xlm、nau-xbc、nau- yzh（其肉质根颜色分别为：红皮白肉、绿皮粉肉、白皮白肉、红皮红肉）作为实验材料。将经过挑选的萝卜种子进行表面消毒，置于潮湿的滤纸上暗培养3天。待其长出幼苗后，转移到盛有腐殖土和泥炭（1:1）的营养钵中，并转入温室中进行培养。

4. 研究创新点

目前已有的与花青素的合成代谢有关的研究多集中于植物地上器官，对植物地下器官的研究相对较少。本课题探究花青素在萝卜肉质根中的合成代谢机制，对花青素生物合成关键基因进行分离克隆和表达分析，对萝卜高花青素品种的选育提供理论依据。

5. 研究计划与进展

实验进度安排：

1）2016.6～2016.8查阅相关中英文献资料，进行预实验；

2）2016.8～2016.11 实验材料播种，花青素含量的测定；