解淀粉芽孢杆菌SQR9中基因ysnE参与吲哚乙酸合成代谢途径的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义

随着我国绿色农业的快速发展，生防菌及其微生物有机肥在防治土传病害方面越来越受到人们的重视。芽抱杆菌是一种好氧或兼性好氧、产芽孢的革兰氏阳性菌的总称，具有分布范围广，易分离和培养，生理特征多样的特征，是土壤、植物根际和根表的重要微生物种群。由于芽抱杆菌能产生耐热和抗逆的芽饱，在生防菌剂中有很高的稳定性，有利于生防菌剂的生产、加工、储存，是一种理想的生防微生物。 本研究旨在确定sqr9中ysne基因的功能及其参与的iaa合成的机理，拟首先分析iaa合成突变体Δysne与野生型sqr9 iaa合成中间产物吲哚类物质的差异；阐明sqr9中ysne基因参与iaa合成的完整代谢途径。预期研究结果将使我们深入了解芽孢杆菌iaa合成机制，探究pgpr菌株促生机理，为其在农业生产的应用提供理论基础。

国内外研究概况

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

在细菌中已鉴定了多种IAA生物合成途径，与植物IAA生物合成途径具有很高的相似性。色氨酸是细菌IAA生物合成的主要前体物质，至少具有5种色氨酸依赖的IAA生物合成途径：吲哚乙酰胺（Indole-3-acetamide, IAM）途径，吲哚丙酮酸（Indole-3-pyruvate pathway, IPyA）途径，色胺（Trytamine, TAM）途径，色氨酸侧链氧化酶（Tryptophan side-chain oxidase, TSO）途径和吲哚乙腈（Indole-3-acetonitrile, IAN）途径。之前我们推测ysnE基因是SQR9中合成IAA的关键基因，在SQR9野生型和突变体发酵中添加几种IAA合成途径中的关键中间产物吲哚类物质，采用用薄层层析(TLC)技术和高效液相色谱（HPLC）分析发酵液组分，探究其产IAA能力。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法和方案

（1）解淀粉芽孢杆菌SQR9双交换法基因敲除

种子液接10 μl至新鲜的液体LB培养基(Zeo 20 μg ml-1)中，37 C，170 r min-1培养至OD 600 为0.5后，加入终浓度为0.5 %木糖相同条件诱导培养1 h。将菌液以每管200 l的量分装到无菌的2 ml离心管中，加入8 l融合片段，37 C，150 r min-1复苏培养8 h后将菌悬液涂布于LB平板(Zeo 20 μg ml-1，Cm 5 μg ml-1)上，放于37 C培养箱中培养到有单菌落长出。接种转化子于LB 试管中(Zeo 20 μg ml-1，Cm 5 μg ml-1)，37 C，170 r min-1过夜培养后分别提取基因组DNA。以转化子的基因组DNA为模板，表4-4中的引物验证转化子双交换的正确性。验证引物分别由上游同源臂的5端以及下游同源臂的3端向外延伸(图1中的vF和vR)，扩增体系以及反应条件同上述三个片段的扩增，其中延伸时间为4 min。

图1 基因敲除技术路线

（2）原始菌株SQR9和突变体菌株生理生长比较

将菌株SQR9和突变子接种于3 ml LB 液体试管(Cm 5 μg ml-1) 中，37 C培养12 h，分光光度计测定OD600, 将菌液OD600 值用无菌水调节至1.0。以1%的接种量接种突变子和SQR9的种子液(OD600＝1.0)于100ml含0.5 mM吲哚乙酰胺、色胺、吲哚丙酮酸、吲哚乙腈、色醇、色氨酸、吲哚乳酸的Landy培养基中，22℃90 rpm避光培养7天，连续测定生长曲线。

测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为：

（3）吲哚中间产物和IAA定量测量

将制备好的野生菌SQR9和突变体ΔysnE菌体种子液分别以1%的接种量接分别种于添加入终浓度为0.5mM 的吲哚乙酰胺、色胺、吲哚丙酮酸、吲哚乙腈、色醇、色氨酸、吲哚乳酸的Landy培养基中，外加一个添加无菌水的空白处理，每个处理3组重复；同样突变体ΔysnE菌中也设置相同重复。22℃ 100rpm避光培养。将培养的第3天、5天分别取上清样收集处理备用。

（4）薄层层析（TLC）分析吲哚中间产物和IAA定量测量

1、收集处理的上清液10mL，加入乙酸乙酯（上清：乙酸乙酯=2：1）,避光200rpm；3h。

2、上清液用1MHCl调PH=3

3、有机相真空浓缩至1 mL。每个时间点的处理样品在硅胶板上以每次4ul点样共60ul。标准样10ul，100mM。

4、上样TLC硅胶板在Buffer（氯仿：甲醇：水=84:14:1）中跑1.5h，后用van Urk ：Salkowski=1:3比例喷涂，90℃孵育10min显色。

5、为了分开ILA和TAM，需要在Buffer异丙醇：水=4:1中上样跑3h。后用van Urk ：Salkowski=1:3比例喷涂，90℃孵育10min显色。

（5）高效液相色谱（HPLC）分析吲哚中间产物和IAA定量测量

将收集处理的样品用2 M HCl调节pH至2.0，等体积乙酸乙酯萃取三次离心，将有机相37C旋转蒸发用1 ml甲醇溶解，过0.22 μm滤膜，放入-20 C冰箱保存备用。然后吲哚乙酰胺、色胺、吲哚丙酮酸、吲哚乙腈、色醇、色氨酸、吲哚乳酸、生长素标样配制浓度梯度为：0.1、1、10，单位为μg ml-1。甲醇溶解的样品及IAA标样采用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1200）分析，条件为：流动相为A（99.9%甲醇：0.1%乙酸）：B（99.9%双蒸水：0.1%乙酸），进样量为10 μl，流速为0.4 ml min-1，柱温为25 C，紫外吸收波长为220 nm。采用梯度洗脱见表1。每个样品重复三次。根据标样浓度梯度及标样峰面积绘制标准曲线，计算样品中吲哚类物和IAA的浓度。

表1 流动相洗脱程序

2、技术路线

（3）可行性分析

课题组在植物促生菌（PGPR）资源挖掘、PGPR菌株促生物质鉴定及机理研究和PGPR与根系互作方面取得了重要的创新成果和研究进展。组内成员具有扎实的植物营养学、微生物学、生物化学及分子生物学基础。

4. 研究创新点

特色或创新之处

对sqr9菌种的ysne突变体产iaa能力进行了分析。

分别采用薄层层析（tlc）和高效液相色谱（hplc）法分析和定量测量吲哚中间产物和iaa。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

3月份到5月份进行毕业实验设计。预计5月中旬进行毕业答辩。