长期不同施肥土壤中草酸氧化微生物群落差异研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

土壤酸化是土壤质量退化的主要表现之一，其原本是一个较为缓慢的过程，但由于人类活动的影响，使土壤酸化过程大大加速。土壤酸化是由于自然和人为因素导致盐基性阳离子减少，而氢、铝离子增加，使得土壤的ph降低^[1]，形成酸性土壤，导致大量营养元素有效性下降，土壤供肥保肥的能力降低，影响作物的产量与品质。在我国酸化土壤面积大、分布广，酸化强度高、危害大，根据统计数据，我国酸化面积达2亿hm²，约占全国面积的23%，主要分布在长江以南热带、亚热带两大地区。大部分酸性土壤ph值低于5.5，酸化严重的土壤ph值甚至低于4.5^[2]，而近三十年来，中国农田土壤的ph值平均更是下降了0.5个单位。

为了改善当下土壤酸化的问题，防止进一步酸化并找到有效的治理酸化土壤的方法，国内外都进行了广泛的研究。现在，对于土壤酸化主要从两方面解决问题，一是使用土壤改良剂，二是利用农业措施。施用石灰等传统改良剂在我国得到普遍的应用，也是最主要的解决方法。石灰能有效降低表层土壤酸度值，中和氢离子浓度，改善土壤结构，并且具有降低土壤中重金属对作物影响的作用，但是对于土壤底层的ph影响不大^[3]，过于频繁的施用会使土壤复酸程度增强，须和其他碱性肥料配合使用^[4]。除了传统的石灰外，一些土壤调理剂也是重要的改良剂，种类较多包括白云石、粉煤灰、磷石膏、磷矿粉、碱渣等工业废弃物。另外，一些有机物料，因含有大量的营养成分，可增加土壤微生物的种类和活性，降低土壤中交换性铝的含量。生物质碳不仅可以中和土壤酸度，还因其含有丰富的营养元素，可以提高土壤中有效养分的含量^[4]。最后是微生物肥料的利用，微生物肥料是一种特定的菌剂，其中含有较多的活性微生物，活性微生物的生命活动能够加快土壤中物质的转化，从而达到降低土壤酸度，改善土壤质量的目的^[5]。除了以上这些土壤改良剂，还有通过控制酸雨，利用土壤动植物和微生物对酸化土壤的修复作用的生物改良，以及改善不恰当的农业措施，减少氮肥使用，增施有机肥，优化耕作模式等方法，改善酸性土壤。近年来我国在修复酸化土壤的新方法研究中也取得了进展，利用工业废弃物改良酸性土壤改良的研究也有所增加，在有机改良方法、生物质炭改良剂和复合改良剂的室内模拟中有良好的改良效果，但真正在田间的使用效果还在进一步的研究。

草酸和草酸矿物质是在土壤中的植物，动物，真菌和细菌的主要次生代谢产物，并且土壤中的草酸分泌对于植物吸收磷和微量元素的有效性增加起着重要的作用^[6]。而细菌对草酸的代谢，已被公认为碳生物地球化学循环的重要组成部分，因为它可以让在热带酸性土壤中的碳酸钙沉淀。草酸碳酸盐通路的中心连接了钙和碳的生物地球化学循环，并且作为一个潜在的长期大气co₂的汇，获得越来越多的关注^[7]-[10]。对于这个途径，ca² ，草酸和草酸降解生物是三个重要因素。草酸降解可由多种植物和微生物进行^[11]，然而，在它的钙盐（k_sp = 2.32*10⁹）的情况下，草酸自发氧化是不可能的因为需要高活化能。只有细菌是迄今已知的能够参与氧化过程,由于强酸变弱的转换^[12]，细菌对草酸分解也伴随着较强的ph升高。最近，特异性基因frc的引物已被设计和测试各种草酸降解细菌和环境样品，可用于多样性或定量研究^[13]。微观实验利用纯培养与田间观察试验，来解决细菌是否可以单独引起对土壤中碳酸钙的沉淀所需的ph值转变和真菌-细菌相互作用对于ph值改变发生的影响，这两个问题。通过实验表明，细菌是土壤的ph值改变的主要原因，但是需要真菌的存在，让可使用草酸作为唯一碳源和能源的细菌保持活性。

2. 研究的基本内容和问题

本实验通过比较不同施肥制度下，土壤氧化草酸钙的情况，并且利用高通量测序技术探究其机理，着重探讨不同施肥制度下氧化草酸微生物群落结构的不同，为以后研究和利用氧化草酸微生物打下一定的基础。对于促进酸性土壤改良研究有着重要影响，对促进我国农业的可持续发展 具有重要意义。

1.研究目标：长期不同施肥制度土壤对草酸钙的响应情况；不同施肥制度下，氧化草酸微生物群落结构的不同。

2.研究内容：①土壤在长期不同施肥水平后，对草酸钙的响应有何变化 ②m和npk处理中的氧化草酸微生物群落结构有何不同 ③哪些因子驱动改变了微生物群落结构的改变

3. 研究的方法与方案

研究方法：试验设置江西的长期定位点，取M和NPK处理，每个施肥处理选取三块小区，采集耕作层020cm的土壤样品，装入自封袋迅速带入实验室4C冰箱保存。取一部分土样，用于基本的理化性质测定；另取一部分鲜土，加入草酸钙培养后提取土壤DNA，用作后续分析。

技术路线：

取长期施肥土样NPK、M处理──加入草酸钙培养──测定其呼气、pH变化──提取DNA，并定量其功能基因──测序分析其群落结

1土壤的培养及其相关测定将江西M、NPK处理的土样分别加入4000ppm的草酸钙进行培养，并且定时采气采样，测定其呼吸和pH的变化。

2 DNA的提取用Power Soil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)试剂盒根据操作指示步骤从0.25g鲜土中提取DNA。提取出来的DNA在浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳上对DNA的浓度和质量通过Nano Drop ND-2000 spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington,DE, USA)进行检测。

3 提取的DNA交由上海天昊基因公司进行测序

4 利用Uparse，Mothur，R语言，SPSS等软件对测序结果以及理化性质进行统计分析。

可行性分析：

选题上，本课题所采集的土壤具有一定的代表性；专业课上学到了大量的关于微生物理论知识，对土壤细菌微生物群落的研究不仅丰富了土壤微生物的构成，更能对之达到更深入的了解；国内外已有大量的类似课题的研究，技术基本已达到成熟阶段，为实验方案提供更有效的依据。

技术和方法上，对于土壤理化性质分析已在本科学习阶段以及在导师的指导下基本掌握；同时导师对土壤微生物的研究已有多年，在研究方法上和技术上都能得到老师的指导与帮助。同时，对相关数据的分析软件如利用mothur，Uparse软件分析高通量测序结果、微生物群落的多样性和丰富度相关性分析等的方法也相对成熟，所以技术和方法上也具有必然的可行性。

实验条件上，本人所在的实验课题组具备用于土壤理化性质分析、DNA提取、PCR等的各种仪器；Miseq高通量测序公司也能对所测序列进行高效测定；所用数据分析软件也能及时在网站下载，故本课题研究在实验条件上也没有问题。

4. 研究创新点

本课题主要研究不同施肥制度下氧化草酸微生物群落结构，很少有对于农田生态系统中草酸-碳酸盐途径的研究，所以本研究具有一定的创新意义。

研究的最终目的在于探索不同施肥对土壤生态的影响。

同时，在对土壤细菌微生物进行测序时，采用的是最新的下一代测序技术，其方法具有高效、准确率高的特点，让课题研究更具严谨性。

5. 研究计划与进展

2017年2月完成土样的培养

2017年3月完成土样dna的提取,并拿到公司进行细菌16s的测序

2017年4月中上旬对土样进行理化性质的分析