转pdmAB基因拟南芥修复土壤中取代脲类除草剂的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在过去的几十年，在农业快速发展以生产更多的农产品以满足需求的同时，人们使用了大量的农药和除草剂。其中取代脲类除草剂广泛使用造成的环境污染是一个全球问题，已引起了人们的极大关注。

取代脲类除草剂自1951年发现灭草隆的除草作用后，这类除草剂就快速发展起来了，如今商品化的品种多达20多种，成为除草剂中品种多、使用广泛的重要一类。例如异丙隆、绿麦隆、敌草隆等。其大多数品种水溶性低，脂溶性差，不易淋溶、抗光解、不挥发，能较长时期地存留在土壤表层，这是其长期危害环境安全的根本特点。另外，取代脲类不抑制种子发芽，主要被植物根吸收，对杂草的主要作用部位在叶片，当叶片受害后自叶尖起发生退绿，然后呈水浸状黄化，最后坏死。再者，其适用于作物范围较广，大多数品种主要防除一年生禾本科杂草及某些阔叶杂草。该类大多数品种杀草原理是抑制光合作用，光照强有利于药效的发挥。除草效果与土壤含水量密切相关，含水量高，除草效果好。^[1]

目前，取代脲类除草剂所带来的问题是其在土壤和水体中残留所引起的环境问题。在许多湖泊和土壤样品中均检测到其存在，所以其广泛的残留所带来的环境问题不容小觑，这严重威胁着人畜的安全。以异丙隆为例，异丙隆是由联邦德国赫斯特公司于1972年研发的应用于农田防治中一年生禾本科杂草和某些双子叶杂草。它是一种选择性除草剂，具有毒性，在土壤环境中，虽可经光解和植物代谢等途径降解，但其造成的危害仍不能忽视。^[2],[3]

2. 研究的基本内容和问题

1. 掌握植物双源载体的构建技术过程。

2. 掌握拟南芥的种植培养技术。

3. 掌握农杆菌将目的基因导入拟南芥的技术过程。

3. 研究的方法与方案

1.将来自于sphingobium sp. strain ybl2的n-脱甲基酶基因 pdma及pdmb的氨基酸序列，通过南京金斯瑞生物科技有限公司genscripts optimumgenetm 密码子优化系统优化，再由该公司合成atctp（拟南芥叶绿体转运肽）1 pdma核苷酸序列及atctp pdmb核苷酸序列，合成的atctp pdma核苷酸序列的5端及3端连接有snabi酶切位点，合成的atctp pdmb核苷酸序列的5端及3端连接有kasi酶切位点。将合成的atctp pdma核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，得到重组克隆载体dbn01-t1。同样的方法，将合成的atctp pdmb核苷酸序列连入克隆载体pgem-t（promega，madison，usa，cat：a3600）上，得到重组克隆载体dbn01-t2。用限制性内切酶snabi单酶切重组克隆载体dbn01-t1和表达载体dbnbc-02，将切下的核苷酸序列片段插到表达载体dbnbc-02的snabi位点之间，构建成重组表达中间载体dbn10938m，用限制性内切酶kasi单酶切重组克隆载体dbn01-t2和中间载体dbn10938m，将切下的核苷酸序列片段插到中间表达载体dbn10938m的kasi位点之间，构建成重组表达载体dbn10938 。

2. 对己经构建正确的重组表达载体dbn10938用液氮法转化到农杆菌gv3101中，然后通过农杆菌介导的的拟南芥花序浸染法，将目的基因pdmab整合到哥伦比亚型拟南芥中。收获的t1 代种子点种在含8 mg/l的草铵膦1/2 ms4固体培养基中筛选。t2代和t3代的种子依据同样的方法进行筛选，最后依据孟德尔的遗传定律筛选得到抗性较好的三种转基因纯合子，命名为t3-2、t3-3、t3-4。

3. 为了研究转pdmab拟南芥的抗性情况，将种子用6%的次氯酸钠消毒15分钟，再用无菌水反复清洗6次，然后点种在含30 ml 1/2 ms固体培养基（含1.5%蔗糖，1%琼脂糖，ph 5.8）的平板上，培养基里加有0 mg/l、2 mg/l、5 mg/l、15 mg/l 异丙隆中。在4摄氏度，避光条件下同步化2天后，将拟南芥平板垂直放置在23-20℃，16h光照/8h黑暗的光照培养箱中生长，30d后测量拟南芥根长、鲜重、叶片表面积大小。

4. 为了研究植物根、叶中ipu及代谢产物的含量，拟南芥根和叶表面用去离子水清先3次，再用20% 甲醇清洗3次去除表面附着的ipu及产物，液氮研磨后，叶样品利用psa/gcb/c18纯化柱纯化去除叶绿素,提取叶中药含量。根样品用1% 的乙酸乙腈直接萃取萃取，待乙酸乙腈挥发后，加100μl甲醇溶解，通过高效液相检测根、叶中ipu及产物的量。所有实验均设有三个重复，野生型和转空载体拟南芥作为对照。

5. 为了研究异丙隆对植物光合作用的影响，将培养基中15d大拟南芥幼苗移植于合成土壤中（121℃灭菌30min），合成土壤含营养土和蛭石，比例为1:3，ph7.20.2。30d后按照异丙隆田间喷药剂量 (1.05-1.2 kg/ha ipu 溶解在750-900 kg/ha 水中), 取0.09 g ipu 溶解于 33 g 水，喷洒于40个花盆总共160颗拟南芥苗中 (20天大)。 7d后取3-5片叶，利用紫外分光光度计测量470，649，及 665 nm的吸光度并计算拟南芥中叶绿素含量。

4. 研究创新点

1. 采用目前环保绿色的转基因植物技术，将pdmAB降解基因与植物双源载体相连，以农杆菌转化法的方式导入拟南芥基因组中，实现表达。

2. pdmAB基因具有降解IPU的功能，其对其它取代脲类除草剂也具有一定的耐受与降解能力。该基因原本发现于微生物基因组中，从环境微生物中获取的与降解功能相关的基因，实现从微生物到植物修复的转化并在模式植物拟南芥中鉴定其功能。

5. 研究计划与进展

研究计划：2016年9月至10月，掌握拟南芥种植技术，包括其在培养基、土壤和水体中栽培、种子收获等相关技术。

2016年10月，完成植物双源载体的构建。

2016年11月，完成转基因拟南芥的培养及纯合子筛选。