斯氏假单胞菌A1501染色体定点突变及基因编辑方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、研究意义氮元素是生命必需的主要营养元素之一[1]，自然界中的氮元素主要以分子态氮（n2）的形式存在于空气中，化学结构十分稳定，无法被生物体直接利用。

固氮作用是分子态氮被还原成氨和其他含氮化合物的过程，只有经过固氮作用形成的氨态氮才可以被生物体利用。

自然界的固氮方式有两种：一是非生物固氮，即通过闪电等自然现象将氮气固定成氮氧化物的过程；二是生物固氮，指原核微生物利用体内复杂的固氮酶系统，在常温常压下将空气中的分子态氮还原成可被生物体吸收利用的氨的过程[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标利用λ-red同源重组技术替换azoarcus olearius dqs-4t株系的谷氨酰胺合成酶基因（glna），建立下一步glna点突变的底盘。

利用crispr-cas技术无义突变glna基因，使glna的翻译提前终止，丧失谷氨酰胺合成酶活性，粗略探究该技术能否应用于内生固氮菌的遗传操作，从而建立该菌的遗传操作系统。

2、研究内容（1）探究azoarcus olearius dqs-4t的基本实验操作条件由于azoarcus olearius dqs-4t的发现时间较短，关于此菌株的相关文献很少，本课题的首要研究内容即探究该实验菌的热激转化、电穿孔等基本实验操作的条件。

3. 研究的方法与方案

1、研究方法（1）λ-red同源重组技术λ-red同源重组技术是基于λ噬菌体red重组酶产生的一种基因同源重组技术。

利用glna两端的同源短序列up、down以及庆大霉素（gentamicin，gm）抗性基因在体外构建重组质粒载体，导入实验菌后，通过重组酶的作用，质粒上up、down序列之间的gm与基因组上的glna进行同源重组，从而将glna用gm替换下来。

（2）crispr-cas基因编辑技术crispr-cas技术能够对实验菌染色体进行精准编辑。

4. 研究创新点

（1）首次在Azoarcus olearius DQS-4T中进行glnA突变缺失迄今为止，尚未发现有关Azoarcus olearius DQS-4T中谷氨酰胺合成酶的相关报道，本课题创新性地提出对glnA的修饰想法，具有原创性。

（2）利用CRISPR-Cas系统进行基因定点编辑除了经典的重组工程方法，本课题引入了近几年迅速发展起来的简单高效的基因定点编辑方法CRISPR-Cas方法，旨在建立该菌株的遗传操作系统。

5. 研究计划与进展

（1）2018.3.2-2018.3.20构建各种重组质粒；（2）2018.3.21-2018.5.5利用构建好的重组质粒获得glnA失活突变株；（3）2018.5.6-2018.5.20整理数据，撰写论文。